[发明专利]一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染的贝类监测方法有效
申请号: | 201310089175.X | 申请日: | 2013-03-07 |
公开(公告)号: | CN103146805A | 公开(公告)日: | 2013-06-12 |
发明(设计)人: | 夏斌;陈碧鹃;辛福言;孙雪梅;崔毅 | 申请(专利权)人: | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 |
主分类号: | C12Q1/48 | 分类号: | C12Q1/48;C12Q1/30;C12Q1/28 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 266071 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 整合 生物 标志 海洋 溢油 污染 贝类 监测 方法 | ||
1.一种用于判断海洋溢油污染水平的贝类监测方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)贝类生物培养:受试生物贝类实验前洗刷干净,取回后置实验室内水族箱中暂养5~7d备用;
(2)石油烃暴露实验:配置一定浓度梯度的石油烃试验液,采用半静水接触染毒法,将暂养过的贝类分成7组,其中1组为对照组,另外6组为试验组,同时每组设定3个平行组,分别放入玻璃缸中,在整个实验过程中持续充气,每隔24h换相同浓度的新鲜试验液,于第15d取样;
(3)抗氧化酶活性的测定:将贝类活体解剖,取出内脏团,于液氮中研磨后称重,经灭菌生理盐水润洗,用滤纸吸干表面水分,迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水中,冰浴匀浆后于4℃条件下3000r/min离心10min,然后取上清用生理盐水配成体积比10%组织匀浆,直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶和过氧化物酶活性的测定,然后分别稀释成体积比5%组织匀浆用于谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的测定;1%组织匀浆用于蛋白含量的测定;
(4)整合生物标志物响应与石油烃浓度的剂量-效应关系:将超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性进行整合,形成整合生物标志物响应指数IBR:
计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X;
数据标准化:X标准化得到Y,Y=(X-m)/s,其中m和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差;
当生物标志物的响应为受活化时,Z=Y;当生物标志物的响应为受抑制时,Z=-Y;
对于每一个生物标志物所有试验水平的Z值最小值为Min,将其绝对值与Z相加得到得分S,S=Z+|Min|,S≥0;利用星状图表示生物标志物的结果,星状图的每个半径坐标对应每次试验水平的一个生物标志物的得分S;以Si和Si+1代表星状图中顺时针方向上的两个连续得分,n为半径的数目,也就是测定的生物标志物的个数;Ai为第i个和第i+1个半径相连形成的面积,可通过下式计算:其中α=2π/n,Sn+1=S1;总面积即为整合生物标志物响应(IBR),
绘制IBR与石油烃含量的剂量-效应关系,结果呈现出显著的线性关系;
(5)海洋溢油污染贝类监测评价:海洋溢油事故发生后,根据溢油扩散的范围设置一定数量的站位S1,S2,....St,同时在清洁海域设定对照站位S0,将已经暂养驯化的贝类转移至溢油海域的站位S1,S2,....St和对照站位S0,放置15d后取出,迅速测定溢油海域站位S1,S2,....St和对照站位S0贝类生物体超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性,并将这些抗氧化酶整合形成IBR,进行方差分析,并用均值多重比较分析法分析对照组S0与溢油站位S1,S2,....St贝类IBR的差异显著性,当P>0.05为差异不显著,表明溢油污染对贝类没有产生明显胁迫,基本没有石油污染;当P<0.05为差异显著,表明溢油污染对贝类中度胁迫,石油污染程度较重;当P<0.01为差异极显著,表明溢油污染对贝类重度胁迫,石油污染程度严重。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤(1)实验用水为沿海自然海水,经砂滤处理,盐度为29.08±0.18,pH为7.85±0.03,温度为21.05±0.43℃,暂养期间连续充气,每24h换水一次;投喂小球藻2次/日。
3.如权利要求1或2任一所述的方法,其特征在于步骤(3)中谷胱甘肽过氧化物酶活性定义每毫克蛋白质每分钟扣除非酶反应的作用,使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位;谷胱甘肽转硫酶活性定义每毫克组织蛋白在37℃反应1分钟扣除非酶促反应,使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位;超氧化物歧化酶活性定义每毫克组织蛋白在1mL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达50%时所对应的超氧化物歧化酶量为一个酶活性单位;过氧化氢酶活性定义每毫克组织蛋白每秒钟分解1pmol的H2O2的量为一个酶活性单位;过氧化物酶活性定义37℃条件下每毫克组织蛋白每分钟催化产生1μg的底物的酶量为一个酶活性单位。
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