[发明专利]一种耐有机溶剂脂肪酶、其编码基因、产生菌株及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程与酶工程技术领域，具体涉及一种耐有机溶剂脂肪酶、其编码基因、产生菌株及应用。 

背景技术

脂肪酶（lipase, EC 3. 1. 1. 3 ,甘油三酰酯水解酶)是类脂化合物分解、合成和酯交换的重要催化剂，其催化反应具有选择性高、反应条件温和、无污染等特点，因此广泛应用于精细化工及手性拆分药物中间体的研究。 

脂肪酶在有机相中可以完成酯化、转酯和酰胺化等反应，并具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性，尤其是它的立体选择催化特性，可以用于化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等。近年来，国内外学者已经致力于应用脂肪酶在有机体系中实现手性化合物，尤其是药物中间体的立体选择性拆分，如利用微生物脂肪酶可完成萘普生、布洛芬、西司他汀重要中间体2,2-二甲基丙烷甲酸等手性药物的立体选择性的拆分。与传统的化学方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反应条件温和、节省能源、专一性强、副反应少、产品纯度高、反应步骤简单、不需手性源、产品成本低等优点。  

脂肪酶在水环境中能够催化酯键的水解，当处于有机溶剂环境中能催化酯交换，酯化，醇解，酸解等反应。而脂肪酶作用的底物往往是水不溶性的，在有机相中才有较好的溶解度，但是在有机溶剂中，大多数酶类活力受到抑制甚至失活，所以其在生物催化中的应用受到很大限制。在有机介质中维持较高的脂肪酶活性及脂肪酶催化底物的广泛性是实际生物催化过程中的难题。因此开发耐有机溶剂脂肪酶在理论和工业应用上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐有机溶剂脂肪酶的产生菌，其产脂肪酶能力高，纯化过程简单。 

本发明的另一目的是提供一种耐有机溶剂脂肪酶，该脂肪酶具有优良的有机溶剂耐受性。 

本发明的另一目的是提供上述脂肪酶的折叠酶。 

本发明的再一目的是提供耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化手性化合物拆分的应用。 

为了实现本发明的目的，本发明首先从油污土样中筛选获得一株有机溶剂脂肪酶生产菌，经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定和16S rDNA序列分析，确定该菌株的分类命名为斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），株名为ZS04，保藏日期为2012年12月21日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2012542，保藏单位地址为：中国，武汉，武汉大学。 

本发明对斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri ZS04的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性菌株，无芽孢。在肉汤培养基中生长24 h后，菌落直径大小为0.6 mm～1.2mm，生长范围为24℃～37℃，最适生长温度为35℃，生长pH为6.0～9.0，最适生长pH为8.0。其生理生化特性表现在：过氧化氢酶反应、氧化酶反应、硝酸还原反应结果为阳性，明胶反应结果为阴性，在有氧条件下生长。 

本发明对该菌产生的胞外酶进行了纯化，SP-sepharose FF 阳离子交换层析一步纯化得到电泳纯的耐有机溶剂脂肪酶，命名为耐有机溶剂脂肪酶ZS04，其比活性达到398.2 U/mg。 

本发明对耐有机溶剂脂肪酶ZS04进行了酶学性质的研究。实验证明该脂肪酶对多种有机溶剂都具有良好的耐受性，有机溶剂中脂肪酶的稳定性提高。其中，亲水性有机溶剂可激活该脂肪酶，使得酶活提高。该耐有机溶剂脂肪酶的最适反应pH为9.0，在pH 7.5～11.0的范围具有很高的稳定性。其最适反应温度为50℃，在30℃以下具有较好的热稳定性。金属离子Ca²⁺，Zn²⁺，Co³⁺等离子可提高该脂肪酶的热稳定性。此酶的最适人工底物为对硝基苯酚月桂酸酯。 

本发明提供斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）ZS04所产耐有机溶剂脂肪酶ZS04的氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示，前24个氨基酸为信号肽。耐有机溶剂脂肪酶ZS04与Pseudomonas stutzeri A1501脂肪酶基因同源性为90%，氨基酸同源性为93%。 

本发明提供耐有机溶剂脂肪酶ZS04的编码基因，如SEQ ID NO：1。该耐有机溶剂脂肪酶编码基因全长为936bp，编码311个氨基酸。 

本发明提供耐有机溶剂脂肪酶ZS04的折叠酶氨基酸序列，如于SEQ ID NO：4所示。