[发明专利]肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

【技术领域】

本发明属于生物检测领域，具体涉及肠致病性大肠杆菌(EPEC)的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。

【背景技术】

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为革兰氏阴性无芽孢短杆菌，大小0.5×1～3μm，多数具周身鞭毛，能运动，能发酵多种糖类产酸、产气，是人和大多数温血动物肠道中的正常栖居菌，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。普通大肠杆菌正常栖居条件下不致病，但若进入腹腔、胆囊、膀胱等处可引起腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎等肠道外感染。大肠杆菌在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在，因此，是饮用水和食物(或药物)的卫生学标准。

大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌，也称为致泻性大肠杆菌，根据不同的生物学特性可将其分为5类：肠道致病性大肠杆菌(EPEC)、肠道产毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠道侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠道出血性大肠杆菌(EHEC)、肠道黏附性大肠杆菌(EAEC)。其中，大肠杆菌O157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌，大肠杆菌O157:H7引起肠出血性腹泻，约2％～7％的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。自1982年由美国首次报道了大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎的爆发以来，包括我国等许多国家都有报道，且日见增加，日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目，在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位，已经成为世界性问题。世界卫生组织已将大肠杆菌O157:H7列为新的食源性疾病病原菌。

普通大肠杆菌和致病性大肠杆菌的传统检测方法需要2d的初发酵、2d的复发酵或增菌，再进行及后续的菌落纯化分离、生理生化鉴定以及血清学鉴定等，由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经愈来愈跟不上人类对致病微，生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物学水平上来研究普通大肠杆菌和致病性大肠杆菌的核酸结构和分子特征，可以大大提高对病原菌的检测和研究能力，提高检测工作效率。

目前，分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的工具之一。环媒等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法，是一种新型等温核酸扩增法，为快速基因检测提供了一种新的技术途径，已具有成功应用的现实性，在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有文献报道。由于环媒等温核酸扩增的扩增过程依赖识别靶序列六个独立区域，所以对于微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点。此外，环媒等温核酸扩增的核酸扩增过程是在等温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，使检测成本大大降低，而PCR则需要昂贵的PCR仪进行一定温度程序的核酸扩增，因而，环媒等温核酸扩增比PCR对仪器设备要求低、检测成本也较低，更具推广性，可望作为常规检测工具。

【发明内容】

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组，其对肠致病性大肠杆菌具有良好的特异性。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种肠致病性大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其便于对肠致病性大肠杆菌进行LAMP检测。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种肠致病性大肠杆菌的LAMP检测方法，其具有特异性良好、灵敏较好、检测快速可靠、操作简单的特点。

上述第一个技术问题通过以下技术方案实现：

肠致病性大肠杆菌的LAMP检测引物组，其特征在于，包括下列引物：

外引物F3：GGTAATACTAACACCGCA；

外引物B3：ATGAGGATATCTACATGCAGTTG；

内引物FIP：

TCAAGGTTGTTGCACTAACACATGTTTGGTTACTATCTGAGTAT；

内引物BIP：