[发明专利]利用超高效液相色谱-质谱联用技术和化学模糊识别研究中药复杂成分配伍相互作用的方法

权利要求书

1.一种中药复杂成分配伍相互作用的研究方法，其特征在于，利用超高效液相色谱-质谱联用技术和化学模糊识别方法；

该方法首先建立包括化合物名称、结构式、分子量、分子式、质谱和紫外信息的中药成分化学物质库，并经过对照品峰的质谱信息，包括碎片离子或裂解规律分析，建立中药中主要类别化合物质谱信号网络，并通过质谱信号网络将所研究中药中的不同成分进行快速鉴别与归类，对已归类的化学物质进行定量分析，绘制已归类的化学物质的配比-溶出变化曲线，进而分析中药复杂成分配伍相互作用变化规律及特点。

2.根据权利要求2所述的中药复杂成分配伍相互作用研究方法，其特征在于，所述的定量分析方法为采用超高效液相色谱与三重四级杆质谱及PDA紫外检测技术联用对样品中成分进行定量分析。

3.根据权利要求2所述的中药复杂成分配伍相互作用研究方法，其特征在于，所述的主要类别化合物包括三萜类、黄酮类、苯丙素类、蒽醌类、香豆素类、木质素类、有机酸或生物碱类。

4.利用超高效液相色谱-质谱联用技术和化学模糊识别方法对甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1) 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的对照品适量，加甲醇制成浓度分别为0.147 μg/mL的 Kansuinin A，0.117 μg/mL的 3-O-(                                               -癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇，0.175 μg/mL的 kansenone，202 μg/mL的大戟醇，1.25 μg/mL的甘草素，5.08 μg/mL的异甘草苷和13.31 μg/mL的甘草酸的混合对照品储备液，以此作为1号混合对照品溶液；        

精密吸取1号混合对照品溶液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀得2号混合对照品溶液，同法采用逐级稀释法制得3 ~ 8号混合对照品溶液，各对照品溶液在进样前经13000 r/min离心10 min，并经0.22 μm微孔滤膜滤过；

(2)供试液的制备：精密称取重量比例为10:1, 5:1, 3:1, 3:2, 3:3, 3:4.5, 3:9, 3:15, 3:30,的甘遂-甘草药材及甘遂、甘草单味药各1.0 g，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，加20 mL甲醇，回流提取2 h，然后取上清液，经13000 r/min离心10 min，再经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，各供试品溶液平行制备6份，各供试品溶液进样前再分别用甲醇稀释40倍；

(3)色谱条件：Thermo C18柱，流动相为：A相：0.1 % 甲酸水和B相：乙腈；梯度洗脱条件：0-8min：10-55% B；8-16min：55-80% B；16-24min：80-100% B；24-31 min：100 % B；31-32 min：100-10 % B；32-37 min：10% B；流速为 0.4 mL/min，柱温35 ℃，进样量为2 μL；

(4)质谱条件与紫外条件

TQ-MS扫描方式为ESI±，扫描范围为 m/z 100-1000，毛细管电压为3 kV，离子源温度为150 ℃，去溶剂化温度为550 ℃，锥孔气流速度为50 L/h，去溶剂化气流速度为1000 L/h，定量检测与分析所用采集方式为多反应监测；紫外检测采用PDA检测器，检测波长范围为190-400 nm；

（5）化学模糊识别方法

化学模糊识别包括四个步骤：

分别建立甘遂和甘草中化学物质的化合物名称、结构式、分子量、分子式、质谱和紫外信息的化学物质库；

选择甘遂和甘草药材中不同类型化合物中含量较高的已知化合物作为对照品，然后选择甘遂、甘草单味药及配伍药材提取液进样，在全扫描图谱中根据保留时间、质谱和紫外信息找到对照品峰，这些对照品的碎片信息和裂解途径将为其它化合物的归类提供依据；    

根据所建立的甘遂、甘草化学物质库，在全扫描图谱中查找响应化合物的分子量，通过质谱信息和紫外信息比较，可将化合物的基本母核结构确定，不同母核化合物归为不同组，这些首先被选择并归类为不同组的化合物成为先驱化合物，根据这些先驱化合物的质谱信息和裂解途径的研究，选择至少三个先驱化合物所共有的质谱碎片信息或裂解途径作为判断这类母核化合物的依据，并建立相应不同母核化合物组的网络用于其它含有相同母核的化合物的归类，最后，根据相应化合物组网络，将还未归类的化合物依据其质谱信息进行归类；

（6）定量分析

对已归类样品中化合物的定量分析选择三重四级杆质谱技术中的多离子反应监测检测模式及PDA联用方法，对于有质谱响应的化合物，采用多离子反应监测定量分析；没有质谱响应但有紫外相应的化合物采用PDA紫外定量分析，以相应结构类型化合物对照品做标准曲线，同一结构类型化合物的定量均用同一个标准品的标准曲线进行定量分析。

5.根据权利要求4所述的利用超高效液相色谱-质谱联用技术和化学模糊识别方法对甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，其特征在于，甘草中归类的先驱化合物包括三萜皂苷类、苯丙素苷及苷元类；甘遂中归类的先驱化合物包括巨大戟烷型二萜、假白榄酮型二萜及大戟烷型三萜。