[发明专利]一种基于单一标准品的四色荧光定量PCR方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测，属于生物技术领域。本发明采用基于单一标准品的四重四色的荧光定量PCR技术，通过一步法PCR扩增检测各类处理后标本中A组轮状病毒（HRVA）、诺如病毒Ⅰ群（NVGⅠ）、诺如病毒Ⅱ群（NVGⅡ）和人星状病毒（HAstV）RNA，用于引起腹泻症候群的轮状病毒、诺如病毒Ⅰ群、诺如病毒Ⅱ群和人星状病毒的实验室快速检测和疫情监控。本发明对引物和探针的设计以及实验的实施也提出了更高的要求。

背景技术

WHO估计全世界每年腹泻病例高达30-50亿例次，有50-100万病例因严重腹泻死亡，平均每天死亡2.5万人，特别在儿童更为突出。临床上小儿各种急性胃肠炎比较常见，可以引起患者呕吐、腹痛、腹泻等症状，是一种急性传染病，一般起病较急，可有发热及全身不适症状。引起急性腹泻的病原很多，可以包括细菌病毒或者其他微生物。自1972年发现诺瓦克病毒后，已相继发现和确立了多种引起腹泻的病毒并能在腹泻患者大便中直接检出病毒。目前研究较多的是各种致病性病毒包括轮状病毒（Rotavirus，RV）、诺如病毒（Norovirus，NV）、人星状病毒（Human Astrovirus，HAstV）以及肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）、柯萨奇病毒（Coxsackie virus，CAV）、札如病毒 (Sapovirus，SV)和肠腺病毒（Enteric adenovirus，EADV）等。

轮状病毒主要感染婴幼儿，秋冬季高发；肠道腺病毒主要感染2岁以下患儿，夏秋季发病率较高。轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，病毒粒子呈圆形，由形似车轮而得名，为无囊膜病毒，病毒基因含有11个节段的双股线型RNA。目前将人和动物状病毒分为A～D4个组。A组为普通轮状病毒（主要引起婴幼儿腹泻）；B组为猪轮状病毒和成人腹泻轮状病毒（Adult diarrhea rotavirus），C组为人和猪轮状病毒；D组为鸡和鸟类轮状病毒。具有11个片断的双股RNA基因组编码6个结构蛋白(VP1-4，VP6-7)和五个非结构蛋白(NSP1-5)，包裹在三层蛋白衣壳内；外层由两个蛋白组成，VP4和VP7，VP4(相对分子质量为88000)蛋白，呈穗状刺突突出于病毒粒子的表面，VP5包含宿主细胞融合区氨基酸384-401，与潜在融合区序列和抗原环绕的氨基酸305有关。VP7是病毒主要的衣壳蛋白。本发明主要针对A组轮状病毒检测。

诺如病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原体，是单股正链RNA，全长约7642nt，包括3 个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）。目前已对其 100 多个分离株进行基因测序。世界不同地区、不同时间流行的NV基因RNA多聚酶区序列相对保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的达到90%以上。NV包括5 个基因群，感染人的包括基因Ⅰ、Ⅱ和IV群，其中以Ⅱ群最多见，Ⅰ群偶见，IV罕见报道。基因群Ⅰ（GenogroupⅠ，NVGⅠ）还包括南安普顿病毒（Southampton virus）、沙漠风暴病毒（Desert Shield virus）；基因群Ⅱ（Genogroup Ⅱ，NVGⅡ）还包括雪山病毒（Snow Mountain virus）、夏威夷病毒（Hawaii virus）、多伦多病毒（Toronto virus）等。因此目前诺如病毒的检测引物以针对Ⅰ（NVGⅠ）和Ⅱ（NVGⅡ）群两种基因型为主。诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），现在的正式名称为札如病毒(Sapovirus，SV)，合称为人类杯状病毒。

星状病毒性胃肠炎主要发生在5岁以下儿童，也可见于老年人。星状病毒于1975年由Appleton和Higgins采用电镜在腹泻儿童的粪便标本中首次发现，星状病毒科包括哺乳类星状病毒（Mamastroviruses）和鸟星状病毒（Avastroviruses）两个属，人类星状病毒归属于哺乳类星状病毒属。星状病毒呈球形，核衣壳为规则20面体，无胞膜，病毒颗粒直径为28nm，约10%的病毒颗粒有特征性的5～6个角；细胞培养获得的病毒颗粒直径为41nm，包括10nm 的刺突。人类星状病毒可分为7个血清型（AstV21～AstV27），7个基因型，人类星状病毒血清型1（HastV21）是流行最广泛的血清型。核酸为单正链RNA，7.0kb，两端为非编码区，中间有三个重叠的开放读码框架（ORF）。该病毒呈世界性分布。