[发明专利]一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法。

背景技术

猪瘟（CSF）是猪的一种重要的传染病，给养猪业造成严重的经济损失。国际兽疫局将猪瘟列入A类法定传染病之一，自1833年首次在美国发现后，此病便遍及全世界，虽然很多国家目前已经消灭了猪瘟，但猪瘟仍然是我国养猪业的第一大传染病。

猪瘟病毒（CSFV）属于黄病毒科，瘟病毒属。该病毒是一种有囊膜的正链RNA病毒，电镜下，猪瘟病毒粒子的形态呈圆形，直径约为70nm。其中内部是电子致密的核心，直径约为40nm，有时呈六角形，外有包膜包裹。表面有6-8nm的流苏样结构，外包宿主细胞源的脂质囊膜，内部呈二十面体对称的核衣壳，脂蛋白囊膜上，存在着病毒基因组编码的囊膜糖蛋白E0、E1和E2，组成核衣壳蛋白的C蛋白与病毒基因组相连，以维持核酸的稳定性。

猪瘟病毒（CSFV）囊膜糖蛋白E2（即gp55蛋白）是目前研究最为清楚的一种结构蛋白，在猪瘟病毒（CSFV）编码的蛋白中，E2是最容易发生结构变异的一种蛋白，但又是猪瘟病毒（CSFV）的主要保护性抗原结构域蛋白，能诱导机体产生中和抗体。E2蛋白有ORF编码的370个氨基酸残基组成，在感染细胞中，其分子量为56kD，主要以同源二聚体或异源二聚体的形式存在于感染细胞或病毒粒子的表面，这主要是因为E2蛋白的羧基端有一段长达约40个疏水性氨基酸残疾的跨膜区。利用这个E2蛋白的各种单抗，人们已经鉴定出猪瘟病毒（CSFV） E2蛋白具有四个主要抗原结构域A、B、C和D，其中A、B、C含有中和性抗原表位，这些抗原结构域位于E2蛋白近N端的1/2部分，且处于两个相对独立的抗原结构单位。人们的这些研究为以后制备猪瘟抗原提供了方便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪瘟病毒特异性抗原蛋白gp55特定位点原核表达方法，所用合成基因如SEQ ID NO.1所示。

上述方法，包括以下步骤：

第一步，给合成基因加上基因引物得目的基因，PCR扩增后产物回收；

第二步，将目的基因导入载体中，形成重组载体；

第三步，重组载体导入原核细菌中进行表达。

步骤（1）中所用基因引物为BamHI酶切位点和HindⅢ酶切位点，其中在5'端加上BamHI酶切位点，3'端加上HindⅢ酶切位点。 

步骤（2）中所用载体为质粒pET28a，所用原核细菌为大肠杆菌，较好的选用大肠杆菌BL21。

本发明对现有的猪瘟病毒E2基因的主要抗原区进行了整合，并针对不同株型的特异性进行兼并性分析，同时避开大肠杆菌中的稀有密码子，以此合成全序列长度为360bp 的xE2核苷酸序列（即合成的基因序列）。采用传统的方法进行表达，方法操作简单，方便，所得抗原蛋白具有强的特异免疫原活性，为今后开发基因工程亚单位疫苗、诊断检测猪瘟抗体和制备检测猪瘟病的单克隆抗体的研究提供了良好的基础。

附图说明

图1为诱导表达猪瘟E2蛋白SDS-PAGE电泳图，图中，第一泳道为Marker ProteinRuler Ⅰ，第二泳道CK为未诱导的大肠杆菌BL21菌株的全蛋白，1、2、3分别是用IPTG诱导后的大肠杆菌BL21全蛋白序列。CK中无目的条带，1、2、3在15KD左右有明显的目的条带；

图2为Ni-NTA亲和层析柱纯化后猪瘟E2蛋白SDS-PAGE电泳图，图中，第1泳道为洗脱柱子时收集的第1毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第2泳道为洗脱柱子时收集第2毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第3泳道为洗脱柱子时收集第3毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第4泳道为洗脱柱子时收集第4毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第5泳道为洗脱柱子时收集第5毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第6泳道为洗脱柱子时收集第6毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第7泳道为洗脱柱子时收集第7毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图；第8泳道为洗脱柱子时收集第8毫升洗脱液的目的蛋白纯化效果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1