[发明专利]一种多片段DNA分子组装方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子克隆技术，合成生物学技术领域，具体涉及的是一种多片段DNA分子组装方法及应用。 

背景技术

目前，虽然有各种适合长片段扩增DNA聚合酶，但是在基因组大片段克隆上仍然存在不足，首先大片段扩增的能力有限10kb左右，其次长片段的突变率会随之增加，但是对于一个完整大片段的测序和回复突变都是需要很长的时间和花费很大的精力。对于全基因合成技术，是通过不对称PCR技术合成初期的PCR片段，但是此PCR片段不可能一次合成很长。所以要通过一定的拼接策略，往往要多轮PCR，但是这样又会带进去较多的突变。同时单纯的使用PCR合成的长度非常有限，往往1kb左右，目前销售的clone eazy系统可以实现分段克隆，所以一些拥有此专利的公司能够实现较长DNA片段的合成，但是此系统需要分段测序，合成速度较慢。在多基因载体构建方面，随着生物学研究的深入，将突破单个基因研究进行多基因相互协调的研究，单个基因进行转化将不能胜任。所以将多个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术将非常必要，目前虽然有一些多基因组装系统，但是操作相对复杂。每个基因加入需要多步的操作，而且不能实现无缝连接。 

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种多片段DNA分子组装方法及应用。主要提供一套适合于多个DNA片段无缝组装成一个完整大片段的方法及其在基因片段合成、含有多个基因的转基因载体构建，合成生物学等方面的应用。 

技术方案：针对目前DNA分子组装方法存在的问题和缺陷，本发明的一种多片段DNA分子组装方法，包括以下步骤： 

1）载体系统构建：该系统由接受载体A1、供给载体B1和/或供给载体B2组成的系统， 

所述接受载体A1含有一组内切酶识别位点，且按照：“载体骨架---反向内切酶识别位点---任意碱基----正向内切酶识别位点----载体骨架”排列，且载体骨架中不含有此内切酶的识别位点； 

所述供给载体B1的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列L_m的顺序排列：“载体骨架---正向奇数位内切酶识别位点--反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点--反向偶数位内切酶识别位点---任意碱基----正向偶数位内切酶识别位点---反向奇数位内切酶识别位点---载体骨架”，或者多克隆位点序列右侧添加目标序列R_n的顺序排列：“载体骨架---正向奇数位内切酶识别位点---反向偶数位内切酶识别位点---任意碱基---正向偶数位内切酶识别位点--反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点---反向奇数位内切酶识别位点---载体骨架”排列，且此供给载体B1的载体骨架中含有的克隆内切酶识别位点被全部剔除，其中m=1，3，5，7……等奇数，n=2，4，6，8……等偶数； 

所述供给载体B2的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列L_m的顺序排列：“载体骨架---正向偶数位内切酶识别位点--反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点--反向奇数位内切酶识别位点---任意碱基----正向奇数位内切酶识别位点---反向偶数位内切酶识别位点---载体骨架”或者多克隆位点序列右侧待添加目标序列R_n的顺序排列：“载体骨架---正向偶数位内切酶识别位点---反向奇数位内切酶识别位点---任意碱基---正向奇数位内切酶识别位点---反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点---反向偶数位内切酶识别位点---载体骨架”排列，且此供给载体B2的载体骨架中不含有克隆内切酶识别位点，其中m=1，3，5，7……等奇数，n=2，4，6，8……等偶数；