[发明专利]水蛭胃蛋白酶酶解物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及到水蛭抗凝血和溶栓的活性成分及其应用。

背景技术

水蛭(Hirudo)系水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman、水蛭 Hirudo nipponica Whitman 或柳叶蚂蝗 Whitmania acranulata Whitman 的干燥全体。性咸、苦，味平，有小毒，归肝经。具有破血通经、逐瘀消癥的作用，临床主要用于防治心脑血管疾病及抗癌，已有研究表明活体水蛭的主要有效成分是水蛭素，药材中有效成分仍不清楚，因此目前多以全粉末入药，存在着剂量大，易造成微生物污染等弊病。鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或者水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收入血而发生药效，故生物酶仿生提取方法模拟体内消化过程，提取的有效成分治疗效果更佳。

发明内容

本发明目的是提供一种抗凝血和溶栓的水蛭胃蛋白酶酶解物及其应用。

一种水蛭胃蛋白酶酶解物，由以下步骤组成的：

A、净选水蛭，粉碎成细粉；

B、向水蛭细粉中加入人工胃液，然后加入胃蛋白酶水解，得到水蛭胃蛋白酶酶解物。

水蛭胃蛋白酶酶解物，由以下步骤组成的：

A、净选水蛭，粉碎成细粉；

B、向水蛭细粉中加入人工胃液，水蛭细粉与人工胃液重量体积比为1:20，然后密闭于43℃恒温水浴30分钟后，再加入2.5%胃蛋白酶水解4小时，然后将酶解液置于85℃恒温水浴15分钟，流水冷却至室温，以4000r/min离心15分钟，取上清液，干燥，得水蛭胃蛋白酶酶解物。

水蛭胃蛋白酶酶解物，在制备抗凝血或溶栓药物中的应用。

为了验证水蛭胃蛋白酶酶解物的抗凝血和溶栓作用，作了如下实验：

水蛭胃蛋白酶解产物抗凝血和溶栓活性评价：

本发明采用活化部分凝血酶时间法（APTT法）和纤维蛋白原平板法对活性成分的抗凝血和溶栓效果进行评价，评价方法如下：

1 材料

1.1　药材

水蛭为全虫干燥体（石家庄以岭药业股份有限公司提供），置干燥箱60℃以下干燥，粉碎成细粉，备用。

1.2试剂

牛纤维蛋白原（Sigma F8630，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；胰蛋白酶1：250（Amresco0458，购自北京华美转导科技有限公司）；胃蛋白酶1：10000（Sigma P7000，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；医用注射性尿激酶（购自北京市望京医院）；凝血酶（Sigma T4648，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；活化部分凝血酶时间（APTT）试剂10*1.5ml（购自上海太阳生物试剂公司）；三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯）。

生理盐水（称取氯化钠9g，加蒸馏水定容至1000ml，摇匀，即得）；人工胃液（取盐酸9ml，加蒸馏水稀释成1000ml，即得）；人工肠液（取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得）。

1.3动物

健康的雄性日本大耳白兔，体重约2Kg(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，符合国家健康一级动物标准。

1.4仪器

UV-2000型分光光度计；800B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；ES-120型电子分析天平（长沙湘平科技发展有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；DZ-1BC型真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

2方法

2.1　胃蛋白酶酶解法

取水蛭细粉，按1∶20比例加入人工胃液（取盐酸9 mL，加蒸馏水稀释成1000 mL，即得。pH1.5。），密闭，于40 ℃恒温水浴作用30 min后加入2%的胃蛋白酶，作用4 h后，将酶解液置于85 ℃恒温水浴作用15 min，流水冷却至室温后，以4000 r·min^-1离心15 min，取上清（pH1.5），残渣备用。上清液分成两部分，一部分低温蒸干，为水蛭胃蛋白酶酶解物Ⅰ；另一部分用NaOH溶液调pH4～5，离心，上清液低温蒸干，为水蛭胃蛋白酶酶解物Ⅱ。

2.2　胰蛋白酶酶解法