[发明专利]Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系及其方法及裸鼠移植瘤模型

说明书

技术领域

本发明属肿瘤生物学领域，涉及一种人胃肠道间质瘤耐药细胞系。根据中性蛋白酶消化原代培养法和/或组织块培养法并作改良，从1例Gleevec治疗失败的GIST患者中成功培养出1株Gleevec耐药的GIST细胞系，建立了Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系GIST-916。 

背景技术

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是位于胃肠道或腹腔内的表达KIT（CD117）蛋白的间叶源性肿瘤，绝大多数存在KIT基因的功能获得性突变，KIT基因突变在GIST发病过程中发挥关键的作用。Gleevec是一种口服的ATP的竞争性抑制剂，能竞争性地结合于KIT酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团从ATP上转移到蛋白质底物（KIT，PDGFRA，ABL以及BCR-ABL融合蛋白）的酪氨酸残基，从而阻断了失控的信号传导通路，进而阻止细胞的持续增殖，并恢复细胞的正常凋亡程序，是靶向治疗胃肠道间质瘤的重要药物。然而一般在Gleevec平均治疗24个月后，将产生耐药，因此研究肿瘤耐药机制以及防止或逆转肿瘤耐药的发生对于提高靶向治疗效果十分重要。近年来，肿瘤耐药细胞系己成为重要的工具，大量研究利用它来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等。建立肿瘤耐药细胞系具有重要应用价值。Gleevec是靶向治疗胃肠道间质瘤的最常用药物，因此有必要建立胃肠道间质瘤Gleevec耐药细胞系作为平台来揭示GIST的耐药机制、逆转耐药以及开发和评价新的抗癌药物等。 

发明内容

本发明的目的是提供一种胃肠道间质瘤Gleevec耐药细胞系及其建立方法，以及一种耐药GIST细胞裸鼠移植瘤模型。 

一种Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系，保藏名为Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系GIST-916，保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072），保藏编号:CCTCC NO：C2012171，保藏时间为2012年11月8日。 

本发明的耐药细胞系建立步骤如下:取部分Gleevec耐药的胃肠道间质瘤组织行原代细胞培养,建立了GIST-916耐药细胞系。用光学显微镜观察细胞形态， MTT法检测细胞耐药指数，行耐药细胞系的基因突变分析，建立耐药细胞系裸鼠移植瘤模型（成瘤情况和移植瘤生长曲线，组织学特征，免疫组织化学检测CD117、Desmin，移植瘤基因突变分析）。我们发现，GIST-916有以下特点：耐药的GIST原代细胞在倒置显微镜下呈互不重叠的单层，细胞生长呈成纤维细胞状，为长梭型;GIST-916对Gleevec具有较强的耐药性，在Gleevec药物浓度在0.05-3μM之间时对细胞系的生长基本没有明显影响，3-5μM时受到轻度影响，但在>10μM的高药物浓度下部分细胞的生长受到一定的抑制;GIST-916细胞系包含KIT基因exon11 1697T→A Val559Asp（V559D）原发突变和exon13 1982T→C Val654Ala（V654A）继发突变。耐药细胞系裸鼠移植瘤模型实验显示：随着接种时间的推移，GIST-916肿瘤的生长逐渐加速，肿瘤体积逐渐增大，细胞成瘤率为：GIST-916组60%（3/5）；GIST-916耐药移植瘤呈混合细胞型，部分区域可见横纹肌肉瘤分化，横纹肌肉瘤分化区域CD117阴性表达，但是Desmin弥漫阳性表达；而其他区域则CD117阳性表达，Desmin阴性表达；与细胞系抑制，GIST-916移植瘤同样包含KIT基因exon11 V559D原发突变和exon13 V654A继发突变。 

一种耐药GIST细胞裸鼠移植瘤模型，建立步骤如下： 

实验动物BALB/C/nu/nu品系裸鼠，无特殊病原体级,雌雄不限,鼠龄3～4周,体重19.0±2.0g；GIST-916细胞系接种5只裸鼠，均接种于背部皮下；其饲养和实验均在无特殊病原体环境中进行；