[发明专利]一种基于顺磁纳米Fe-Ni-Co合金探针的NMR食源性致病菌快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种致病菌的快速检测方，尤其涉及一种基于纳米Fe-Ni-Co合金探针的NMR食源性致病菌快速检测方法。

背景技术

基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。Fe-Ni-Co合金材料具有铁磁性，当粒子直径小到一定程度会出现顺磁特性。即没有外加磁场时没有磁性，而在有外加磁场时表现出一定的磁性，可以用于磁分离。同时，顺磁性物质对核磁共振信号的影响十分显著，微量的顺磁性物质就会使核磁共振信号表现出变化。因此可以构建顺磁性的特异性Fe-Ni-Co合金纳米探针生物传感器，从磁共振的角度来做检测。

其主要的原理步骤：1. 检测目标菌的特异性顺磁纳米Fe-Ni-Co合金探针的制备。从市场上购买纳米Fe-Ni-Co合金材料，也可以通过其他方法制备纳米级的Fe-Ni-Co合金。使用硅烷偶联剂，其通式为:Y(CH₂)nSiX₃。此处，n为0-3；X为可水解的基团；Y为有机官能团。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si(OH)₃)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。通过修饰抗体可实现表面功能化，形成特异性免疫探针，再封闭多余的活性位点。由于纳米Fe-Ni-Co合金探针具有顺磁特性，因此，可以通过外加磁场分离没有联上的抗体。2. 将另一部分目标菌的特异性单克隆抗体采用一定的方法固定在固相载体表面，并将多余活性位点封闭，备用。3. 将第1步修饰过的特异性免疫探针加入待检样本，充分混合震荡抓取目标菌后，上磁力架分离。由于纳米Fe-Ni-Co合金具有顺磁特性，探针会汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出探针。若待检样本中有目标菌，则被探针所富集。撤去磁力架加少量无菌的去离子水则形成目标菌的探针悬浊液；此时，抓到目标菌和未抓到目标菌的探针还是混在一起。4. 将上述混在一起的探针，加到第2步的固相载体表面，则抓取了目标菌的探针将与固相载体表面单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将没有抓取到目标菌的探针洗脱。5. 再采用洗脱剂将固定载体上的结合的特异性纳米免疫探针洗下来，用外加磁场的磁分离方法清洗掉离子、溶剂。此部分探针如果存在，就是抓取了目标菌的探针。由于Fe-Ni-Co合金具有顺磁特性，对于共振仪器非常敏感，相对于其他分子而言，微量的纳米Fe-Ni-Co合金能够大幅降低无菌的去离子水的自旋-晶格驰豫参数T1和自旋-自旋弛豫时间T2，而无菌的去离子水在一定的均匀场强下，T1/T2是固定的。将洗脱液置于核磁共振仪中，与无菌的去离子水对照组进行对照。显著发生T1/T2值降低的说明有探针存在，从而间接说明食品样品中有致病菌检出。探针含量与T1/T2值降低呈正比。通过加标，可以定量检测目标菌。该方法中纳米Fe-Ni-Co合金探针既是分离富集的手段，同时纳米Fe-Ni-Co合金具有的顺磁特性，又可作为定量检测的探针。该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。所有的食品标准，致病菌都不得检出。因此，用该方法可做大规模待检样本的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。目前，国内外还没有文献报道这种方法。

发明内容

一种基于顺磁纳米Fe-Ni-Co合金探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价。该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。

一种基于顺磁纳米Fe-Ni-Co合金探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，核磁共振仪对顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与Fe-Ni-Co合金纳米粒子含量的相关性指标。不同的致病菌检出下限不同。