[发明专利]一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母菌中的高效表达的方法，还涉及一种黄曲霉尿酸氧化酶的纯化方法。

背景技术

尿酸（又称2，6，8--三氧嘌呤）是人体内嘌呤内化合物代谢的最终产物，血尿酸水平取决于尿酸产生和排泄的动态平衡，而血浆尿酸的饱和度：37℃，PH7.4时为380～420μmol/L(6.4～7.1mg/dL)。

尿酸大多经肝尿酸盐氧化酶(尿酸酶)分解形成尿囊素由尿中排出，人类尿酸为内源性嘌呤，经黄嘌呤氧化酶在肝、肠作用形成最终降解产物。外源性嘌呤亦为尿酸重要来源。国内资料显示，男性平均为5.7㎎/dL，女性4.3mg/dL，其中2/3经尿排除。影响尿酸水平的因素很多，如嘌呤代谢和尿酸合成的酶活性，肾脏滤过及主动转运功能，药物(如长期服用利尿剂)，饮食结构(如酗酒、嘌呤类物质摄入过多)及全身性疾病(如高血压病、全身紫绀性心脏病、慢性阻塞性肺气肿)。

升高的血尿酸在关节中形成尿酸钠水合物的微结晶，会引起痛风性急性关节炎的反复发作，关节、骨骼、软组织的痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累积肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。有资料显示我国20岁以上的人群高尿酸血症的发病率为2.4-5.7%，且有10%会发展成为痛风。

如果血清中的尿酸的浓度高于正常值，就导致高尿酸血症（Hyperuricemia）。高尿酸易在关节中形成尿酸钠水合物的微结晶，会引起痛风性急性关节炎。另外恶性肿瘤的增殖会加快核酸分解代谢，嘌呤代谢产生生大量的尿酸会导致会出现该症状出现。肿瘤放射化疗过程也因为细胞的大量裂解而出现伴随高尿酸血症的肿瘤消退综合症（tumor lysissyndrome,TL S）。TLS会增加胞内物质如钾、磷、钙、尿酸等的浓度，大大超过了人体肾脏的排泄能力，导致高尿酸、高钾、高磷、高钙、高尿酸等症，最后导致肾脏衰竭。我国每年新发的癌症病人约为170万，大部分在发病以后采用化疗和放疗等治疗手段，而化疗和放疗时细胞分裂过剩和急剧破坏，核酸分解突然增多产生大量尿酸，导致尿酸血症，引起结石和肾衰，给病人带来生理和心理上极大的痛苦。

目前控制TLS的有饮食控制、水合、碱化酸毒症，用别嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段，但别嘌呤醇是靠抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而阻碍黄嘌呤和次黄嘌呤转化为尿酸，干扰6-巯基嘌呤的代谢，影响肿瘤的代谢，而且由于黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化受阻，相应的增加了肾脏的负荷，黄嘌呤比尿酸更难容与尿中。用别嘌呤醇治疗的病人可能会出现黄嘌呤肾病和结石。另外，别嘌呤醇对病人体内存留尿酸的排泄没有作用，而且有2%的病人再用别嘌呤醇的治疗过程中会产生过敏反应，甚至出现严重的超敏反应综合症，对于急性高尿酸血症的病人，别嘌呤醇也不能起到及时的治疗效果。

尿酸氧化酶（尿酸氧酶，Urate Oxidase,Uricase）普遍存在与自然界，在大多数动物体内该酶参与嘌呤代谢，将尿酸氧化为尿囊素。尿囊素是一种比较容易排泄的代谢物，其溶解度为尿酸的5-10倍，但在人和一些长灵类体内缺乏这种酶而尿酸作为最终产物而排出体外。1943年，Oppenheimer首次通过实验发现注射尿酸氧化酶可以降低血尿酸水平。1957年，动物来源的尿酸氧化酶用于临床治疗获得了一定的成功。1974年（Current Rheumatol ogy Reports2001,3:29-35）从微生物Aspergillus flavus中提取了尿酸氧化酶治疗痛风，而且这种直接提取的天然尿酸氧化酶也在欧洲上市已有20年，通过注射给药用于白血病化疗的严重高尿酸血症。但从微生物Aspergillus flavus中直接提取酶周期长，发酵过程难于控制，易受病原体污染，产率低，产品纯度不高，在使用中产生还会产生副作用。1992年有人用基因重组的大肠杆菌来尝试对黄曲霉尿酸氧化酶基因进行胞内表达（J.Biol.Chem.1992,267(12):8565-8570），有酶活性，但表达量低，无产业化前景。近几年酿酒酵母表达的基因重组的Aspergillus flavus尿酸氧化酶(Leplatois P.et al.,Gene.,1992,122,139-145)先后在欧洲和美国上市（商品名Fasturtec），用于高尿酸血症的预防和治疗（肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防），但该方法表达的重组尿酸氧化酶以可溶解的活性形式畜积在胞内空隙中,这增加了提纯到药用级的难度；并且利用酿酒酵母作为宿主菌，会出现糖基化修饰过度的问题，这也增加了蛋白后处理的难度。