[发明专利]一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，还涉及该测定方法的应用，如产前检测。

背景技术

当前，产前检测越来越受到人们的关注，产前检测是减少出生缺陷儿的有效措施之一。但是传统的侵入性诊断技术对母亲和胎儿都会造成一定的风险，因而在临床上限制了其运用。

近年来，无创伤性产前诊断受到越来越多的关注，而孕妇血浆中胎儿游离DNA的发现无疑为无创伤性产前诊断开辟了新的途径。因此，围绕孕妇血浆游离DNA的研究越来越多，也发展出了许多潜在的临床应用。比如，母体血浆中胎儿DNA含量的异常与许多妊娠相关的疾病有关，包括先兆子痫、早产、产前出血、侵入性胎盘形成、胎儿唐氏综合症和其他胎儿染色体非整倍性。因此，母亲血浆的胎儿DNA分析可以作为监测胎儿健康的潜在标志物之一。

然而，由于母亲血浆中胎儿游离DNA的含量只占总数的5%-30%，是处于一种高母体DNA的背景下，使得我们在进行无创产前诊断的过程中常常会因为胎儿游离DNA的含量过低而呈现假阴性的结果。为了同母亲来源的游离DNA区分，目前选取胎儿游离DNA标记物主要来自Y染色体遗传位点，这使得胎儿游离DNA含量的检测局限在怀男性胎儿的孕妇当中。因此，开发一种能够广泛应用的检测孕妇血浆中胎儿DNA含量的新技术，是一项意义深远的工作。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种操作简单、准确度高、应用广泛的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法。

技术方案：本发明提供的一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，包括以下步骤：

步骤一，单核苷酸多态性位点的筛选：从美国国立生物技术信息中心（NCBI）的单核苷酸多态性位点库（dbSNP）中初步筛选出满足以下条件的单核苷酸多态性位点：

（1）小等位基因频率（MAF）在0.4-0.5之间；

（2）包含该多态性位点的DNA片段长度为50-70bp；

（3）位点上下游距离位点1-60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点；

（4）包含该多态性位点的DNA片段不是位于基因组变异数据库中拷贝数变异范围之内；

（5）该多态性位点所处的片段在人类基因组范围内是特异的，保证该片段在人类基因组上是唯一的；

（6）包含该多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45-55%之间。

步骤一中，单核苷酸多态性位点的筛选可利用软件完成，包括以下步骤：

（以下步骤根据附图1得到，然而，该步骤及附图1并未显示筛选出该多态性位点的DNA片段长度为50-70bp；此外，附图1上两端50-60bp不包含SNP位点请根据之前修改的权1修改）

（1）从美国国立生物技术信息中心（NCBI）的单核苷酸多态性位点库（dbSNP）中依据小等位基因频率数值过滤，提取出小等位基因频率在0.4-0.5之间的单核苷酸多态性位点，提取出的片段长度为50-70bp；

（2）将步骤（1）得到的单核苷酸多态性位点与人类基因组比较，提取出在人类基因组上是唯一的单核苷酸多态性位点；

（3）过滤步骤（2）得到的单核苷酸多态性位点，提取出位点上下游距离位点1-60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点的单核苷酸多态性位点；

（4）将步骤（3）得到的单核苷酸多态性位点与美国国立生物技术信息中心（NCBI）的基因组变异数据库（DGV）中拷贝数变异（CNV）信息进行比较，过滤掉包含拷贝数变异（CNV）信息的单核苷酸多态性位点；

（5）将步骤（4）得到的单核苷酸多态性位点与BWA索引数据库比较，并过滤，使剩余的单核苷酸多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45-55%之间。

步骤二，血浆中位点DNA的提取：提取待测血浆中游离DNA，并分离出包括步骤一获得的位点序列的游离DNA片段：首先根据筛选出的位点设计探针；将探针绑定到生物磁珠上；将样品DNA加入到带有探针的生物磁珠中，使DNA与探针杂交；洗去多余的DNA模板；将绑定的样品DNA从生物磁珠上洗脱下来。

步骤三，PCR扩增反应：对步骤一中获得的单核苷酸多态性位点序列设计PCR引物，并利用聚合酶链反应（PCR）扩增步骤二分离的游离DNA片段，得PCR扩增产物；