[发明专利]用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。

背景技术

人腺病毒（Human Adenovirus，HAdV）是一群无包膜的双链DNA病毒，分为1～55个血清型，分别划入A～F共6个血清学分组。人腺病毒经呼吸道和消化道传播，引起多种感染，对小儿和免疫缺陷者危害严重。腺病毒感染人体可能引发的疾病包括：急性腺病毒肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎、乳糜泻和急性间质性肾炎等。在儿童急性下呼吸道感染患者中腺病毒感染阳性率可高达4.1%。在最近几十年的北美、欧洲及亚洲均认为人类腺病毒B组感染是导致急性呼吸系统感染（ARD）的重要因素。

HAdV11、HAdV14型属于腺病毒B组，传统的HAdV11型主要导致肾及泌尿系统的感染，HAdV14则引起人呼吸系统感染。新发现的人类腺病毒55型（HAdV55），在其现之初命名为HAdV11a，对人有较强的致病性，易在军队、学校等密集人群发生呼吸道传染病流行，在免疫低下的人群中甚至出现了死亡病例。基因分析表明HAdV55是HAdV14与HAdV11的Hexon区域重组并发生若干核苷酸突变得到的毒株。

实时定量PCR技术是近年来发展起来的一种PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时监测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板进行定量的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大、实验操作繁琐、检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。

本发明提供的第一种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。

本发明提供的第二种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。

以上任一所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示，或所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互补序列所示。

所述特异探针可为TaqMan探针。所述特异探针具体可为在序列表的序列3所示单链DNA的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭基团得到的探针。所述特异探针具体可为在与序列表的序列3所示单链DNA反向互补的单链DNA的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭基团得到的探针。所述荧光基团具体可为FAM荧光基团，所述猝灭基团具体可为TAMRA荧光猝灭剂。其它荧光基团及猝灭基团也可采用。在探针完整时，荧光基团和淬灭基团在空间结构上相互靠近，探针5’末端的荧光报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移（FRET）而被3’端的淬灭基团淬灭，因此检测不到荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，引物和探针与模板特异性结合；TaqDNA聚合酶基于模板在引物3’末端合成互补DNA序列；随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5’->3’外切酶活性对互补结合在模板上的探针进行切割，从而释放出荧光报告基团，其与探针3’末端淬灭基团的FRET被破坏，报告基团所释放荧光无法被淬灭基团屏蔽，从而可被检测到。由于每一条新合成DNA链对应一条探针及其荧光报告基团的释放，因此应光亮的增加与PCR产物的积累是呈比例关系的。利用阳性梯度模板如梯度稀释的病毒DNA或含有病毒特异核酸的质粒等循环阈值（Ct，Threshold Cycler，超过阈值的PCR循环数）对应模板拷贝数或病毒滴定度制成标准曲线，根据待测HAdV55型病毒样品的Ct值即可通过与标准品的Ct值测出样品的起始拷贝数或病毒滴度。

本发明还保护序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。

本发明还保护与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。

本发明还保护序列表的序列3所示的单链DNA分子或与序列表的序列3所示的单链DNA分子反向互补的单链DNA分子。

本发明还保护以上任一所述所述特异引物对和/或以上任一所述单链DNA分子在制备辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒中的应用。