[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗

权利要求书

1.肠出血性大肠杆菌O157：H7多价融合型重组菌，其构建方法为：

根据GenBank中O157：H7EDL933的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：

fliC-P1：5-ggggagctcactattaccaacaaa-3          Sac I

fliiC-P2：5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3            Xhol I

hcpA-P1：5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3         Xhol I

hcpA-P2：5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3       EcoR I

tir-P1：5-gatgaattcgagccggatagccca-3             EcoR I

tir-P2：5-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3              Sal I

eae-P1：5-ttagtcgaegctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3     Sal I

eae-P2：5-ggctctagattattctacacaaaccgc-3                 Xba I

O157：H7过夜培养物，1mL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；

扩增fliC片段的上下游引物分别加有Sac I和Xhol I酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有Sal I和Xba I酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有Xhol I和EcoR I酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoR I和SalI酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟；

fliC-P1和fliC-P2、hcpA-P1和hcpA-P2、tir-P1和tir-P2、eae-P1和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和811bp；

将扩增的PCR产物用质量比1.2％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A缓冲液的0.5体积的DE-B缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液I500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液II750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段；

将Sac I和Xhol I酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pCold I片段4uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0uL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用Sac I和Xhol I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到fliC片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC重组质粒；用Xho I和EcoR I酶切hcpA片段和pCold I-fliC重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC取4.0uL，hcpA片段取2uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，补水2uL，一同加入eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA重组质粒；用EcoR I和Sal I酶切tir片段和pCold I-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0uL，补水3uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒；用Sal I和Xba I酶切eae片段和pCold I-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pCold I-fliC-hcpA-tir和eae各取4.0uL，T4DNA连接缓冲液和T4DNA连接酶各1.0ul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pCold I-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pCold I-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21(pCold I-fliC-hcpA-tir-eae)。