[发明专利]高免疫原性狂犬病毒固定株的选育及其在疫苗开发中的应用

权利要求书

1.高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于：包括如下步骤：

（1）鼠脑毒种的扩增和纯化

从国内外被普遍认可的病毒保藏机构取回aG株或经动物脑组织传代建株的狂犬病毒固定株，病毒接种于20-25日龄豚鼠脑腔，豚鼠出现典型狂犬病症状时，无菌条件下取脑，加入维持液A：含0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0后，研磨脑组织制成匀浆，高速离心除去沉淀，上清液经蔗糖密度梯度超速离心3-5小时，收取蔗糖浓度为45%-55%的组份，透析去除蔗糖，稀释制成滴度为9.0-10.0LogLD50/ml病毒悬液；

（2）鼠脑病毒对Vero细胞：非洲绿猴肾细胞的适应培养

贴壁培养24-72小时的Vero细胞，用胰蛋白酶消化并离心收集细胞；加入含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0，制成密度为5×10⁵-2×10⁶cells/ml的细胞悬液；按病毒∶细胞为1∶1——1∶100的量加入步骤（1）制备的病毒悬液,25-40℃条件下放置10-60分钟；加入含5-10%牛血清的M199培养基,PH7.0-8.0，接种细胞培养瓶，接种量0.5×10⁵-1×10⁵cells/cm²,37℃条件下贴壁培养；24-48小时后培养液更换成含0.5%牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0，30-34℃条件下贴壁培养；96-144小时后收获培养液，蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，为低代次细胞适应病毒；

（3）Vero细胞培养病毒在裸鼠脑组织中扩增

步骤（2）得到的病毒悬液接种裸鼠脑腔，裸鼠出现典型狂犬病症状时，无菌条件下取脑，按步骤一同样方法制备病毒悬液；

病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代

重复步骤（2）和步骤（3），病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代2-10次，制备Vero细胞传代培养的病毒悬液；

（5）可使Vero细胞适应的病毒突变体包括高免疫原性的突变体不断得到优选的方法：

病毒在Vero细胞上连续传代

步骤(4)得到的病毒悬液接种贴壁培养的Vero细胞，32-34℃培养72-168小时，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定病毒滴度，并在Vero细胞上连续传代，直到病毒滴度高于7.5LogLD₅₀/ml；

(6)可使Vero细胞适应的病毒突变体包括高免疫原性的突变体进一步得到优选

病毒单克隆纯化、筛选和保存建株

步骤(5)得到的滴度高于7.5LogLD₅₀/ml的病毒培养液，按文献方法制备Vero细胞的病毒蚀斑，微型注射器吸取单斑病毒培养液，经Vero细胞扩大培养，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法测定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活标定病毒免疫原性，选取病毒滴度高于7.5LogLD₅₀/ml、免疫原性比活高于2.0的多个单斑病毒培养液分别进行分装、冷冻干燥后保存于-20℃冰箱；

对保存的毒种进行基因组序列分析，并与起始鼠脑毒种比较，病毒基因组的碱基序列和病毒蛋白的氨基酸序列均出现明显差异；

（7）选育毒种的传代稳定性分析

步骤六得到的若干株候选毒种，在Vero细胞上连续传15代以上，每代或隔三代进行一次检定：小鼠脑腔法测定培养液病毒滴度、ELISA方法抗原含量、NIH方法测定效力、以效力/ ELISA抗原量的比活标定病毒免疫原性、病毒基因组序列分析和病毒蛋白氨基酸序列分析测定毒种遗传稳定性，选取以上各项检定数据至少15代以内保持稳定的候选毒种作为疫苗生产用毒种；

上述的百分含量为质量百分含量。

2.根据权利要求1所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于：所述的病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代5-8次，制备Vero细胞传代培养的病毒悬液。

3.根据权利要求1或2所述的高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于：所述的病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代6次，制备Vero细胞传代培养的病毒悬液。