[发明专利]人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将特异性识别脑钠肽的噬菌体粒基因3C1用NocI和NotI双酶切后插入到pET22b质粒中，构建成重组质粒pET22b-3C1；将所述重组质粒pET22b-3C1转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，得到基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS；

b)将所述基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取单克隆菌至2YT培养基中，37℃培养过夜，按1∶100比例转接后继续培养至OD_600nm≈0.4，加1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导4个小时；离心收集菌体，超声破菌，获得包涵体后洗涤、溶解，取上清过Ni-NTA亲和柱，纯化产物进行复性处理，获得重组目的蛋白3C1。

2.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中2YT培养基的成分为胰蛋白胨1.6g，酵母提取物1g和氯化钠0.5g溶于1L蒸馏水中。

3.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中将经离心获得含重组蛋白3C1的菌体先重悬于pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，随后与100μg/ml溶菌酶混合，于30℃裂解30分钟，于4℃进行超声破菌，经12000r/min离心15min获得包涵体。

4.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中洗涤步骤中采用的洗涤液成分为：含2mol/L尿素的50mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化钠及2％TritonX-100(v/v)，溶解步骤中采用的裂解液成分为：含8mol/L尿素的100mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化钠，5mmol/Lβ-巯基乙醇及5mmol/L咪唑。

5.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述复性处理过程为：将10mg经Ni-NTA亲和柱纯化得到的变性基因工程抗体3C1逐滴加入到100ml复性液中，4℃过夜后，用透析缓冲液及PBS于4℃分别透析12小时，获得有活性的重组蛋白3C1；其中，所述复性液成分为：含2mol/L尿素的100mmol/L pH8.0Tris-HCl及0.5mol/L L-精氨酸，所述透析液成分：含20nmol/L氯化钠的80mmol/L pH8.0Tris-HCl及0.4mol/L尿素。

6.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS的脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述制备方法得到的人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1，其特征在于，3C1基因全长为717bp，对应239个氨基酸，单链抗体分子量约为25128.82；等电点预测值为9.28，为碱性蛋白；二级结构预测显示3C1含45％α螺旋，39％D折叠，5％β转角；三维结构预测显示3C1重链和轻链形成一个疏水口袋，链接部游离于此结构之外，符合单链抗体的结构特点，具有抗原结合位点的空间构象。

8.根据权利要求7所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1，其特征在于，所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1具有特异性中和脑钠肽活性的人源化单抗的体外活性；所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1在间接酶联免疫吸附法检测中与BNP特异性结合，在直接竞争酶联免疫吸附法检测中对BNP多肽具有中和效应，在点杂交法检测中对BNP检测灵敏度为10ng。

9.根据权利要求7所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1在制备治疗脑性盐耗综合征的药物中的应用。