[发明专利]一种快速分离纯化及富集派琴虫的方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境监测及免疫诊断领域，特别涉及一种对贝类样品中派琴虫的快速分离纯化及富集的方法。

背景技术

派琴虫是世界动物卫生组织（OIE）规定的必报水生动物疾病之一。目前在世界范围内广泛流行，对世界水产品生长繁殖带来了极大的危害，并对水产品养殖及贸易造成了严重的经济损失。2008年农业部首次将派琴虫病列入了蛤仔主要感染的寄生虫病。吴绍强等于2008年5月至2009年5月期间对我国东部沿海一带（其中包括青岛、山东、宁波和福州等监测点）的监测点海域采集菲律宾蛤仔，并对派琴虫感染情况进行调查，结果显示蛤仔派琴虫的感染率在43.75%-95.83%之间不等，几乎每只蛤仔体内都有派琴虫的感染（Shao-qiang Wu,Cai-xia Wang,Xiang-mei Lin,et al.Infection Prevalence and Phylogenetic Analysis of Perkinsus olseni in Ruditapes philippinarum from East China[J].Diseases of Aquatic Organisms,2011，96(1):55-60）。

鉴于派琴虫对水产品危害的严重程度，国内外开展了很多的研究工作。梁玉波等于2001年应用巯基醋酸盐培养基（FTM）培养法成功培养派琴虫（梁玉波.菲律宾蛤仔体内寄生帕金虫的研究[D].大连：中国科学院海洋研究所.2005.1-131）。目前，OIE规定为“黄金标准”的检测方法是巯基醋酸盐培养基（FTM）培养法，该方法被广泛地应用于派琴虫的鉴定中，但是此类方法操作过程耗时过长，敏感性较低，只有当每克组织虫体数大于10³个时方可检出虫体（Uchida E,Kogi M.Optimization of the virus concentration method using polyethyleneimine-conjugated magnetic beads and its application to the detection of human hepatitis A,B and C viruses[J].J Virol Methods,2007,143(1):95-103.）。另外，派琴虫还有其它一些检测方法，如普通PCR、荧光PCR、原位杂交、组织切片以及环介导等温扩增（LAMP）等方法，感染率低的贝类样品极易出现假阴性。因此，研究一种快速分离纯化、富集及鉴定派琴虫的方法对我国贝类养殖则显得十分重要和迫切。

磁性微球（Magnetic microspheres，MMS）是一种新型的功能材料，它通常由具有磁性的内核及核外包裹的高分子外壳两部分组成。磁性微球可与抗体、抗原、核酸等偶联，在反应体系中识别相应的抗原、抗体和核酸，从而达到分离或检测的目的。免疫磁性分离技术(Immunomagnetic Separation，IMS)是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合形成抗原-抗体复合物，此复合物在磁场的作用下定向移动，从而分离抗原。免疫磁性分离技术具有分离样品速度快、特异性强、操作简单、不需要昂贵的仪器设备等特点，而且不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能，目前已在医学和生物学的许多方面发挥了重要作用，尤其是在分离及鉴定病原体方面应用广泛。

激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM）工作原理为同屏采集显示3个不同发射波长的荧光色及1个混合色图像，对研究2种及2种以上物质的共存有明显优点。在显微镜的载物台上加一个微量步进马达控制载物台的升降，最小步进距离为0.1μm，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本的各个光学横断面的图像，实现“光学切片”的目的。通过不同的焦平面产生的光学切片，可得到一块较厚标本的三维图像，这是LSCM最重要的作用之一。将存储在计算机中的光学切片的焦平面信息结合起来，即可描述该标本的三维图像。目前LSCM最大有效解析厚度为0.45mm，扫描最小距离为0.1μm。

吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可通过与DNA和RNA的连接碱基对和磷酸盐基团结合，使细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。吖啶橙在稀溶液中呈绿色；在浓溶液中，由于出现二聚体和多聚体而呈现橙红色。由于DNA是高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，故发绿色荧光；而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光。