[发明专利]单分子生物反应器制备单微纳米珠携带单根多聚物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的单分子多聚物与单个纳米珠连接与富集的方法，具体是在上游用一种单分子生物反应器，将单根多聚物分子连接到单个微纳米珠上，在下游用分离与富集器收集单个微纳米珠只连接一根多聚物分子的目的产物。

背景技术

经微纳米珠连接单根多聚物（DNA、RNA、蛋白质和肽核酸等）分子进行单分子操纵，可用于检测多种生命现象的单分子基本行为，包括核酸与核酸、核酸与相关蛋白相互作用动力学、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。比较常用的办法是采用光学镊和磁镊操纵连接单分子多聚物的微纳米珠，但如何快速和简便制备这种单个微纳米珠连接单根多聚物分子，一直没有很好解决。

经对现有文献检索发现，Dapprich,J.&Nicklaus,N.等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子位移将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文（Dapprich,J.&Nicklaus,N.DNA attachment to optically trapped beads in microstructures monitored by bead displacement.Bioimaging,6:25-32,1998），文中称他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一根DNA片段，但该方法需要光学镊，步骤比较繁琐，效率也较低。因此，本发明要解决的技术问题是提供快速、简便、大量制备并富集“单个微纳米珠携带单根多聚物分子”（以下称“目的产物”）的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速、简便制备单个微纳米珠连接单根多聚物分子的方法，用于在单分子水平研究核酸与相关蛋白分子相互作用动力学、遗传诊断、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代核酸测序仪的样品制备等。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种制备单个微纳米珠连接单根多聚物分子的方法，具体是：采用一内部有溶液通道的流室，流室分为上游的单分子生物反应器和下游的目的产物分离与富集器，上游的单分子生物反应器，设有多聚物进样口和微纳米珠进样口；将多聚物溶液和微纳米珠悬浮液注入流室，使反应成份在反应器充分反应后彻底完成连接，完成反应器的功能；连接反应后的混合物经溶液通道进入流室下游的目的产物分离与富集器，目的产物分离与富集器上游设有填充电泳缓冲液进样口连接流室溶液通道，流室通道末端设有目的产物收集口和空微纳米珠出口，分别连接目的产物收集容器和空微纳米珠收集容器；目的产物收集容器连接电源正极，与目的产物收集容器对应的流室溶液通道另一处连接电源负极，利用外加电场，使携带负电荷的目的产物经目的产物收集口进入目的产物收集容器，空微纳米珠通过空微纳米珠出口进入空微纳米珠收集容器，完成目的产物分离与富集器功能。

本发明方法中，所述多聚物和微纳米珠，可以采用现有方法制备，也可以按照以下方法制备：

步骤一，在多聚物（包括DNA、RNA、以及二者之一与蛋白质或肽核酸连接后的多聚物嵌合体）一端标记一种活性基团，另一端或侧链标记荧光分子，纯化后溶解于连接缓冲液；

步骤二，采用可与标记多聚物活性基团发生连接反应的另一种活性基团包被微纳米珠，纯化后溶解于连接缓冲液。

本发明方法中，对于在中性溶液携带负电荷的核酸分子，可直接按上述步骤实施，对于蛋白质和肽核酸等多聚物分子，则需要事先连接一段核酸作为电分离的介体，形成多聚物嵌合体。

所述的多聚物，是核酸、以及核酸与蛋白质、核酸与人工合成的肽核酸多聚物连接后的嵌合体。

所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直径在纳米至微米量级。

所述的荧光标记，是可以用于荧光显微镜观察多聚物的一类荧光分子。

所述的标记多聚物分子和包被微纳米珠的活性基团，是二者能够发生免疫绑定、直接或介导形成共价键的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可，包括但不限于：生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基（包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等）、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等。