[发明专利]生物复合物的分离与收集方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物复合物，具体是一种生物复合物的分离与收集方法，尤其是一种单个微纳米珠携带单根多聚物分子的分离与收集方法。

背景技术

经微纳米珠连接单根多聚物（DNA、RNA、蛋白质和肽核酸等）分子进行单分子操纵，可用于检测多种生命现象的单分子基本行为，包括核酸与核酸、核酸与相关蛋白相互作用动力学、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。比较常用的办法是采用光学镊和磁镊操纵连接单分子多聚物的微纳米珠，但如何快速和简便制备这种单个微纳米珠连接单根多聚物分子，一直没有很好解决。

经对现有文献检索发现，Dapprich,J.&Nicklaus,N.等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子位移将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文（Dapprich,J.&Nicklaus,N.DNA attachment to optically trapped beads in microstructures monitored by bead displacement.Bioimaging,6:25-32,1998），文中称他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一根DNA片段，但该方法需要光学镊，步骤比较繁琐，效率也较低。因此，本发明要解决的技术问题是提供快速、简便、大量制备并富集“单个微纳米珠携带单根多聚物分子”（以下称“目的复合物”）的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物复合物的分离与收集方法，从连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物中，快速简便的得到大量单个微纳米珠携带单根多聚物分子的复合物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种生物复合物的分离与收集方法，该方法的目的是分离与收集单个微纳米珠携带单根多聚物分子复合物（目的复合物），按照以下步骤实施：

第一步，采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游有进样口和电泳缓冲液填充口，流室溶液通道下游有目的复合物收集口和空微纳米珠出口；

第二步，将连接单根荧光标记的多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物从进样口注入流室，同时将电泳缓冲液从电泳缓冲液填充口注入流室；混合物和电泳缓冲液同时沿着流室的溶液通道流向下游，电泳缓冲液在溶液通道的一侧或者四周填充，从而在混合物液流的一侧或者四周形成屏蔽流；

第三步，在流室溶液通道两侧、目的复合物收集口和空微纳米珠出口上游，设有电极连接通道，在电极连接通道处安装正、负电极对，正极与目的复合物收集口位于同一侧，负极与空微纳米珠出口位于另一侧；正、负电极连接连续直流电源或单极性矩形脉冲电源；

第四步，混合物样品流和电泳缓冲液在流经电极对形成的电场时，连接单根多聚物分子的单个微纳米珠因为携带净负电荷，在外加电场力作用下，离开样品液流进入通往目的复合物收集口的液流并最终进入目的复合物收集容器，空微纳米珠不携带净电荷，不受电场力影响经空微纳米珠出口流出进入空微纳米珠收集容器。

所述的多聚物分子，是核酸（DNA和RNA）、核酸与蛋白质以及核酸与人工合成的肽核酸多聚物连接后的嵌合体，在连接反应前，一端连接活性基团，另一端或测链用荧光分子标记。

所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直径在纳米至微米量级。所述的微纳米珠包被有能与多聚物分子携带的活性基团发生连接反应的活性基团，该活性基团可以是中性、酸性或碱性，为中性时，直接按上述步骤实施，为酸性或碱性时，在多聚物与微纳米珠完成连接反应后，用能与之中和的试剂发生反应，钝化微纳米珠，使之不携带净电荷。

所述电泳缓冲液填充口可以设置为鞘流或侧流方式；设置为鞘流时，电源正极与目的复合物收集口位于同一侧，电源负极与空微纳米珠出口位于另一侧；设置为侧流时，电源正极和目的复合物收集口的位置与填充电泳缓冲液进入流室通道时的位置位于同一侧，电源负极和空微纳米珠出口的位置与样品进入流室通道时的位置位于同一侧。填充电泳缓冲液，起到屏蔽微纳米珠因布朗运动和扩散而进入目的复合物收集口的作用。

所述的电泳缓冲液，是用于将溶液的pH值维持在近中性范围以分离目的复合物的溶液，可以是Good缓冲液，如25mM Hepes（pH7.5），1M KCl，或其他电泳缓冲液，如Tris-TAE、Tris-TPE、Tris-TBE或碱性缓冲液等。