[发明专利]一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺

权利要求书

1.一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）分别为L1、L2、L3，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，L1的保藏编号为ACCC11080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCC11106；其特征在于，包含以下步骤：

a）固体斜面培养：将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中：地衣芽孢杆菌L1的培养条件为30～37℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25～30℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28～32℃，24～48h；

b）理化因子诱变：将步骤a）中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，分别用0.9%的生理盐水制备成浓度为10⁸～10⁹个/ml（血球计数浓度）的菌悬液；然后将制得的菌悬液进行紫外诱变处理，按照致死率70%～90%的处理剂量进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，并用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30℃培养48h，至长出单菌落；

c）摇瓶筛选：无菌条件下，将步骤b）中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30℃培养48h，得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30℃恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛；

d）根据步骤c）中的二次复筛结果，选取芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株，分别用接种针接入斜面培养基，于30℃培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30℃培养22h，得摇瓶种子液；

e）发酵培养：将步骤d）中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5℃，罐压：0.03～0.05MPa，pH值为6.3～6.6，流量1:0.3～1:0.8，转速300rpm，至芽孢率大于85%时放罐。

2.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤a）、c）、d）中所述的斜面培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.2～2.5%、蔗糖0.5～3.5%、酵母粉0.1～2.0%、牛肉膏0.5～1.5%、胰蛋白胨0.5～3.0%、磷酸氢二铵0.1～2.0%、氯化钠0.5～3.5%、硫酸锰0.005～0.1%、硫酸铵0.5～3.5%、磷酸氢二钾0.1～0.5%、硫酸镁0.1～0.5%、琼脂1.5～2.2%、余量为水，pH为6.5～7.5。

3.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤b）中所述的紫外诱变处理方式为：将菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下，距离30cm，分别振摇60s、90s、120s，然后于暗光处，30℃培养16h。

4.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤b）中所述的亚硝基胍诱变处理方式为：将菌悬液与200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合，于37℃下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应。

5.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤b）中所述的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.2～2.5%、酵母粉0.1～2.0%、牛肉膏0.5～1.5%、胰蛋白胨0.5～3.0%、氯化钠0.5～3.5%、硫酸锰0.005～0.1%、硫酸铵0.5～3.5%、磷酸氢二钾0.1～0.5%、硫酸镁0.1～0.5%、琼脂1.5～2.2%、余量为水，pH为6.5-7.5。

6.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤c）中所述的摇瓶发酵培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖2～4.5%、黄豆饼粉1～3.5%、玉米粉0.8～2.0%、酵母粉0.2～1.0%、磷酸二氢钾0.2～1.0%、磷酸氢二钠0.2～1.0%、硫酸镁0.02～0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。