[发明专利]一种制备耐热脂肪酶的方法及其专用表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备耐热脂肪酶的方法及其专用表达载体。

背景技术

脂肪酶是一种羧酸酯酶，能够在油水界面催化长链甘油三酯的水解和合成反应。许多脂肪酶具有高度的化学选择性、区域选择性、底物选择性和立体选择性，能够在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，不易产生副产物，因此脂肪酶在食品加工、手性化合物合成、环境治理、生物柴油合成等工业方面有着广泛的应用。脂肪酶的来源包括动物、植物和微生物。相对于动植物脂肪酶，微生物脂肪酶具有更广的作用pH值，作用温度范围和底物特异性，是工业用脂肪酶的重要来源。脂肪酶Btl2的编码基因btl2克隆自一种极端耐热的细菌嗜热链状芽孢杆菌（Bacillus thermocatenulatus），该酶具有较高的温度稳定性，广泛的pH稳定性且在多种有机溶剂中保持酶活稳定，在工业领域特别是生物柴油工业中具有巨大的应用价值。

毕赤酵母异源蛋白表达系统是近年来应用得比较多的酵母蛋白表达系统，该系统被认为是表达外源蛋白的理想系统，具有很高的商业应用价值。这个系统的优点有以下几个方面：毕赤酵母表达系统具有AOX1强启动子，可以有效调控外源蛋白的表达；毕赤酵母的分子生物学背景清晰，遗传操作简单；该菌体比较容易实现高细胞密度培养，有利于发酵生产。这些优点使得毕赤酵母表达系统成为被广泛利用的外源基因表达系统，表达不同的蛋白质。

目前，已经有在大肠杆菌中表达嗜热链状芽孢杆菌脂肪酶Btl2的报道，虽然目的产物的表达量比较高，但表达产物主要集中在细胞内，需要进行后续的分离纯化，提高了成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将脂肪酶Btl2编码基因插入毕赤酵母表达载体中，得到的表达脂肪酶重组载体；

所述脂肪酶Btl2编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述重组载体中，所述毕赤酵母表达载体为pPICZα。

本发明的另一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为将上述重组载体导入毕赤酵母菌中得到的重组菌。

在本发明的实施例中，毕赤酵母菌具体为毕赤酵母X33。

上述的重组载体或上述的重组菌在制备脂肪酶中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述脂肪酶具有如下1）和/或2）所示的特征：1）胞外分泌；2）耐热。

本发明的第三个目的是提供一种制备脂肪酶的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，收集发酵产物的上清液，得到脂肪酶。

上述方法中，所述发酵按照如下步骤进行：

1）将上述的重组菌在发酵培养基中培养，在培养过程中流加补料；

2）向1）培养得到的发酵体系中流加甲醇溶液诱导培养；

所述补料为含12ml/L PTM1的质量百分含量为50%甘油水溶液；

每1L的PTM1按照如下方法制备：6g CuSO₄·5H₂O、0.08g NaI、3g MnSO₄·H₂O、0.2g NaMoO₄·2H₂O、0.02g硼酸、0.5g CoCl、20g ZnCl₂、65g FeSO₄·7H₂O、0.2g生物素、5.0ml H₂SO₄，用水定容到1L；

所述甲醇溶液为含有12ml/L PTM1的甲醇溶液。

上述方法中，步骤1）中，所述培养的pH值为5.0，所述培养的溶氧量为20%；所述培养时间为30.5h；所述流加补料为在所述培养开始24h后，流加补料4h；

步骤2）中，所述诱导培养的pH值为6.0，所述诱导培养的溶氧量为20%；所述诱导培养的时间为100h，自步骤1）的培养开始记作第0h（请核实）；

所述流加甲醇溶液为待步骤1）培养30.5h后流加所述甲醇溶液，使甲醇在发酵体系的终浓度控制在0.2%-0.5%（体积百分含量）。