[发明专利]一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法。

背景技术

滇池的富营养化过程从二十世纪70年代后期开始，进入二十世纪80年代，特别是90年代，富营养化日趋严重。20世纪60年代末无论草海还是外海水质均为Ⅱ类；70年代为Ⅲ类；70年代后期，水质开始恶化，草海水质80年代变为Ⅴ类，90年代为劣Ⅴ类，严重富营养化，局部沼泽化；外海水质二十世纪80年代为Ⅳ类，90年代为Ⅴ类，严重富营养化。

湖泊富营养化致使藻类异常增殖，并释放生物毒素，这些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的安全。其中以微囊藻产生的微囊藻毒素引起了人们的广泛重视，特别是其中的微囊藻毒素LR是目前已知急性最强、危害最大的一种淡水蓝藻毒素。微囊藻毒素的化学结构如图1所示。

微囊藻毒素对人类健康所构成的风险主要体现在以下几个特性的结合：

1、微囊藻毒素在环境中出现的可能性将越来越大。随着内陆湖泊水体富营养化现象的日趋严重，蓝藻爆发现象时有发生。水华蓝藻中常含有能产生微囊藻毒素的藻类，如：微囊藻、鱼腥藻、念珠藻等。微囊藻毒素虽然产生于藻类细胞内，但随着细胞的死亡和细胞膜破裂而被释放到水中。

2、微囊藻毒素的稳定性较好，有较好的热稳定性和在光照条件下的稳定性。Wannemacher(1989)在实验条件下证实，微囊藻毒素LR在300℃条件下仍然稳定。Harada等（1996a）在实验条件下模拟日本夏季蓝藻水华发生时湖水常见的pH（9-10）和温度（25-30℃）发现，微囊藻毒素LR很少分解；当温度为40℃时，微囊藻毒素LR的半衰期为3周（pH1）或10周（pH9）；模仿夏季自然条件下的降解速率比温度为40℃、pH9条件下稍慢，即半衰期可能大于10周。 Tsuji等（1994）将溶解于蒸馏水中的微囊藻毒素及其几何异构体至于太阳光照射或日光灯下照射，经过26天，仍然有86%以上的微囊藻毒素LR的存在。

3、微囊藻毒素LR具有强烈的肝毒性。一旦摄入人体，能够专一性结合并强烈抑制肝细胞内蛋白磷酸酶的活性，从而引发肝脏的损伤。特别是其中的微囊藻毒素LR是最常见和毒性最强的一种藻毒素，世界卫生组织(WHO)和我国《生活饮用水卫生标准》GB 5749—2006对饮水中的藻毒素含量的限制为1ug/L,并都为微囊藻毒素-LR的含量。

以上几种特性的组合构成了对人类健康的潜在风险。考虑到微囊藻毒素在环境中出现的可能性将越来越大，在环境监测领域开展对水体中，特别对集中式饮用水源地中微囊藻毒素LR含量的监测显得尤为重要。

目前水中微囊藻毒素的监测已有标准检测方法——GB/T20466-2006《水中微囊藻毒素的测定》，该标准中的液相色谱法是使用最为广泛的方法。该方法需要使用含有浓度已知的微囊藻毒素标准溶液制作工作曲线和了解微囊藻毒素在色谱柱上的保留时间以及其它一些光谱信息，从而达到定量、定性分析的目的。

对于微囊藻毒素的提取、纯化方法，1970 年M urthy 最先报道了对微囊藻毒素进行提取, 他们利用透析、溶剂萃取和DEAE-Sephadex A-25 色谱柱进行毒素的提取, 而直到1982 年才获得足够的纯毒素进行结构分析。以后又出现许多不同的提纯方法, 比较典型的方法是以蓝藻细胞为对象, 经过提取、浓缩和分离等过程, 获得微囊藻毒素纯品。对藻毒素提取的方法中，经常采用不同比例的甲醇溶液或5%的乙酸溶液对藻样进行浸泡，并配以搅拌和振荡, 以及(超)声波降解的方法，但很少有明显的证据表明哪种提取方法是最好的。在浓缩方面，近年来，固相萃取成为藻毒素提取的重要方法，采用反相C18填料作为固体萃取相，采用甲醇为洗脱液或采用含0.1%三氟乙酸(TFA)的90%甲醇溶液为洗脱液。在分离方面，色谱技术被用来提纯大量的微囊藻毒素和微囊藻毒素变体,最常采用的有尺寸排阻色谱、离子交换色谱、薄层色谱、高效液相色谱等。制备微囊藻毒素的原料方面，常常以实验室分离培养产毒藻种为原料，但这种方式一方面提高了生产成本，另一方面由于原料的限制也无法进行大规模的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法，其特征在于，包括以下几个步骤： 

A、用生物网捞取滇池爆发期的水华，再通过过滤筛过滤藻样；

B、对处理后的藻样进行反复冻融处理；

C、将经过B步骤处理后的藻样浸泡在乙酸溶液中，浸泡过程中，同时配以超声波仪，进一步破坏细胞壁， 离心，取上清液；