[发明专利]一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用

说明书

技术领域　  

本发明涉及一种植物表达载体的构建及应用，具体涉及一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用，属于生物技术领域。

背景技术    

甘蔗（Saccharum Complex）是最主要的糖料作物，蔗糖占世界食糖总产的76%，占我国食糖总产的92%；甘蔗也是最重要的生物质能源作物之一，是迄今大田栽培作物中单位面积生物量和燃料乙醇产量最大的C4植物。甘蔗品种改良对产业科技进步贡献率高达60%，但是甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物，遗传背景非常复杂，表现为异源多倍体和多倍的非整倍体，染色体个数40～120个不等，变化幅度之大为其它作物所不及，常规有性杂交育种，从实生苗开始一般需要10～13年才能从10～30万株分离群体中培育出1个达到审（鉴）定要求的品种。

现代分子生物学的发展和研究技术手段的进步，使品种的定向改良和目标性状育种成为可能。利用转基因技术改良甘蔗品种具有独特的优势，原因在于：（1）甘蔗属于转基因安全等级为I级的工业原料作物，批准转基因甘蔗产业化应用相对容易；（2）甘蔗又是无性繁殖作物，只要选到优良的单株就可以通过离体无性繁殖的方式，快速扩大群体并保持遗传上的稳定性。目前甘蔗转基因技术主要有两个途径，一是基因枪轰击法，二是农杆菌介导法，二者在甘蔗遗传转化上已经有应用实例，但是这两种技术在甘蔗转基因应用上，转化效率都很低。为了提高甘蔗转化效率，仍需进一步对转化体系进行优化。但是目前用于体系优化的瞬时表达载体转化效率低，不利于对甘蔗遗传转化体系的优化。为此，为了建立更好的甘蔗转基因优化体系，我们探讨了一个新的瞬时植物表达载体构建及其在甘蔗遗传转化上的应用，目的是获得一个瞬时表达效率高的载体，从而能更有效地对甘蔗遗传转化体系进行优化，进而建立一种可实现甘蔗高效转化的技术方法，为甘蔗转基因改良提供技术支撑。 

发明内容

本发明的目的是提供一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法及应用。针对现有甘蔗遗传转化体系优化时所用载体瞬时表达效率不高问题，提供一种转化效率高的载体。通过克隆获得瞬时基因表达盒，进而将其构建到植物表达载体中，获得一个新的瞬时植物表达载体，提高转化效率，从而建立更好的甘蔗外源基因遗传转化体系。 

本发明的目的是通过以下方法实现的。 

本发明的一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建；其特征在于操作步骤如下： 

1、引物设计：人工设计合成特异引物序列

Forward primer: 5’- GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC - 3’

Reverse primer: 5’- GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC - 3’；

　  2、PCR扩增： PCR反应体系是10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 2.0 μl，10 μmol/L的Forward primer 1.0 μl，10 μmol/L的Reverse primer 1.0 μl，5 U/μl的Ex Taq 酶0.125 μl，100 ng/μl的DNA模板1.0 μl，加ddH₂O至终体积25 μl；PCR程序是95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环，最后72℃延伸10 min；所述DNA模板是以pCAMBIA2301质粒为DNA模板；