[发明专利]用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物及检测方法。 

背景技术

稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟是水稻的主要害虫，其危害会造成叶片枯白、枯心苗、白穗，瘪谷大量增加，严重影响水稻产量。转Bt毒蛋白基因水稻对稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟具有良好的抗性，种植Bt水稻既可以有效避免稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟对水稻的危害，又可以减少杀虫剂的使用，减轻环境污染。水稻科学家们已经培育出一些列的转Bt基因水稻 (Tu et al., 2000; Ye et al., 2001; Chen et al., 2005; Tang et al., 2006)，这些Bt水稻为培育抗螟虫水稻新品种提供了种质资源。 

T1C-19是一个转cry1C基因水稻新品系，对稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟具有良好的抗性（Tang et al., 2006；Zheng et al., 2011），是进行抗虫水稻育种的良好亲本。利用T1C-19作为抗虫基因供体，以优良常规水稻品种（品系）作受体进行杂交（回交），在选育过程中利用分子标记对抗虫基因进行跟踪，从而选育出抗螟虫的优良水稻新品种（品系）。 

目前所用的检测cry1C基因的分子标记主要是根据导入的外源基因片段序列设计的特异性显性标记（Tang et al., 2006；Yang et al., 2010），该标记只能检测目标基因的有无，不能区分杂合基因型和纯合基因型，需要在下一代对基因型进行验证，因此显性标记进行分子标记辅助育种效率低，耗费时力。因此，有必要针对T1C-19中的外源基因设计一个能区分杂合基因型和纯合基因型的共显性标记检测体系，在以T1C-19为亲本的抗虫水稻育种中跟踪抗虫基因，以提高育种效率。 

发明内容

本发明的目的是提供一个用于检测T1C-19及其衍生材料中的cry1C基因的PCR检测体系，利用该体系对水稻植株进行检测，可以判断该植株中cry1C基因的基因型。该体系可应用于分子标记辅助育种中对cry1C基因的检测。 

本发明提供的技术方案是：一个用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物，包含正向引物C1和反向引物C2或C3；其中：正向引物C1：序列为5’-cacgaaagagaagggcactc-3’，反向引物C2：序列为5’- tcccagataagggaattaggg - 3’， 反向引物C3：序列为5’- gcaactgtgttgtaggtatg -3’。 

本发明还提供了一种检测转基因水稻T1C-19中外源基因的的方法，同时在一个PCR反应体系中用正向引物C1和反向引物C2、C3，对T1C-19或其衍生的后代材料基因组DNA进行多重PCR扩增，检测扩增产物带型。如果只能扩增出一条512bp片段而没有386bp片段，表明该水稻中cry1C基因纯合；如果只能扩增出一条386bp片段而没有512bp片段，表明不具有cry1C基因；如果同时扩增出512bp片段和386 bp片段，表明该水稻中cry1C基因杂合。 

本发明正向引物C1位于T1C-19或其衍生的后代材料基因组中T-DNA左侧水稻基因组295-314bp；反向引物C3位于T1C-19或其衍生的后代材料基因组中 T-DNA右侧水稻基因组54-73bp，反向引物C2位于T1C-19或其衍生的后代材料基因组T-DNA左侧179-199bp。在有T-DNA插入的DNA链中，C1和C2扩增区域为512bp，C1和C3之间扩增区域大于5kb，在本专利所述PCR扩增体系和反应条件下没有扩增产物；在无T-DNA插入的DNA链中，C1和C2没有扩增产物，C1和C3扩增区域为386bp。 

所述PCR扩增体系为： 10×含Mg²⁺的PCR缓冲液1.5μl，2.5 mmol.L^-1 dNTP 1.2μl， Taq DNA聚合酶1U，T1C-19或其衍生的后代材料基因组DNA模板1μl，10 mol.L^-1的C1 0.5μl、10 mol.L^-1的C2 0.4μl、10 mol.L^-1的C3 0.2 μl，ddH₂O补足体积15μl。 

所述PCR反应条件为： 94℃预变性4min，94℃变性 40 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；然后72 ℃延伸5 min。