[发明专利]转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞信号转导和表观遗传学领域，具体地说，涉及转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用。

背景技术

盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB），化学名为α-[(叔丁胺基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，最初是作为克喘素、氨哮素被合成出来的，用于防治支气管哮喘等疾病，后来作为兴奋剂用于竞技运动中。而CLB最广泛的用途是在畜牧业中作为饲料添加剂“瘦肉精”，不仅可以提高畜禽的生长速度，还可以显著减少脂肪沉积，提高胴体瘦肉率，但是因其在动物体内的残留会使人中毒而被禁止使用。这些功能都源自于盐酸克伦特罗是β2-肾上腺素受体激动剂，可以结合肾上腺素受体（adrenergic receptor，AR）进而激活下游一系列信号通路，影响脂肪和肌肉组织的脂类代谢。

大量研究结果表明，CLB和β2-AR结合后，使β2-AR的化学结构发生变化，可以激活Gs蛋白的α亚基（Gsα），进而激活细胞膜上腺苷酸环化酶，催化ATP成为第二信使cAMP，cAMP可以使蛋白激酶A（PKA）释放催化亚基到核内催化其它蛋白的磷酸化，其中包括转录因子CREB（cAMP反应元件结合蛋白，cAMP responsive element binding protein，CREB）的磷酸化，进而调节很多依赖CRE元件的基因转录。

CRE元件在基因的启动子区，靠近转录起始位点，通常是一组8bp的反向互补序列（5'-TGACGTCA-3')，而一半的CRE元件5'-TGACG-3'和5'-CGTCA-3'序列也可以起到相同的作用。Creb基因的两个主要翻译产物是CREBα和CREBΔα，前者有14个氨基酸的α区域，具有较高的活性。人与猪的CREBα和CREBΔα蛋白质序列是完全相同的。依赖CREB的基因表达需要其KID结构域Ser133位点磷酸化，再结合CREB结合蛋白（CBP）的KIX结构域，从而以复合物的形式调控基因表达。

CREB调控转录的分子机制已确定。被公认的CREB目的基因的功能涉及信号转导、新陈代谢、神经传递、细胞结构等。但是CREB所能调控的目的基因及所涉及的功能还未被全部发现并报道。

2009年有报道证明组蛋白去甲基化酶JHDM2a敲除的小鼠比野生型小鼠更肥胖。JHDM2a（JMJD1a；KDM3a）含JmjC功能结构域，能够特异去除组蛋白H3K9的甲基基团，需要铁Fe(II)和α-酮戊二酸作为辅助因子。JHDM2a的去甲基化作用可以直接调控细胞脂类代谢PPAR通路上的基因表达。

激动剂盐酸克伦特罗引起的脂肪沉积减少，是否涉及表观修饰酶作用，为研究者提供了新的思路。

发明内容

本发明旨在提供转录因子CREB在表观遗传学中的新用途，具体提供转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用。

为了实现本发明目的，其是通过在猪体内过表达CREB，或通过提高猪体内CREB的磷酸化水平，或通过促进猪体内CBP蛋白与磷酸化的CREB的结合，从而上调猪体内JHDM2A基因的表达，使其从表观遗传学方面调控脂类代谢通路，从而减少猪脂肪沉积。

目前已有大量证据表明组蛋白修饰酶调节关键的生物学功能与基因表达，但是关于这些酶是由哪些转录因子调控的报道却很少。本发明通过一系列生物学软件来分析人和猪JHDM2a启动子上的转录因子结合位点。经过分析，发现JHDM2a基因启动子上存在CRE元件，即CREB结合的保守序列。

由此推断JHDM2a的表达是受CREB调节的，需要p-CREB/CBP直接结合在其启动子的CRE元件上。CREB的磷酸化受cAMP-PKA通路调控后，直接激活JHDM2a启动子的活性，从表观遗传学方面协助盐酸克伦特罗调控代谢及其他相关基因的表达，从而使脂肪细胞体积减小，肌肉纤维变得粗大。

CREB直接激活JHDM2a的表达通过以下实验结果进行验证：

1、饲喂了CLB的香猪肌肉组织中，JHDM2a的表达量升高

提取全同胞香猪的CLB饲喂组和对照组的总RNA和核蛋白，通过电子克隆获得猪组蛋白H3K9去甲基化酶JHDM2a及其他代表性的表观修饰酶的序列，分别在mRNA和蛋白质水平上检测JHDM2a及其它酶在CLB饲喂组和对照组香猪肌肉组织中的表达情况。荧光实时定量PCR和western blot杂交的结果均显示，在肌肉组织里，各表观修饰酶中JHDM2a的表达量升高最为显著（图1A）。