[发明专利]一种多功能克隆载体及其使用方法

权利要求书

1.一种多功能克隆载体,其特征在于：其构建方法如下，

（1）设计一对具有5'端磷酸化引物序列如下:

F:5'-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATA-3'

R:5'-TACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-3'

所述引物5'端的第一个碱基为A或者G；

（2）PCR扩增

以PUC19质粒为模板，使用高保真酶PCR扩增得到足量的产物，然后用DpnI内切酶消化掉残留的模板质粒，胶纯化得到的产物即为多功能克隆载体。

2.根据权利要求1所述的一种多功能克隆载体，其特征在于：所述的PCR反应体系及条件如下：

反应体系设计为50μl总体系，具体是5×PCR Buffer6μl，浓度为2.5mM的dNTPmix2μl，浓度为10mM的上下游引物各1μl，浓度为2U/μl的Phusion DNA聚合酶0.3μl，DNA模板1μl，用灭菌水补足50μl体系；

反应条件为：95℃3min预变性，循环内98℃10s变性，52℃退火20s，72℃延伸2min,35个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后16℃保存。

3.根据权利要求1或2所述的一种多功能克隆载体，其特征在于：所述DpnI内切酶消化反应体系和条件如下：

酶切反应体系:10XBuffer4μl，DNA1.5μg，DpnI内切酶1.5μl，灭菌去离子水补足到40μl；

反应条件37℃，1hr。

4.一种权利要求1-3的多功能克隆载体的使用方法，它包括以下步骤：

（1）设计一对具有5'端磷酸化引物，并保证引物5'端的第一个碱基为A或者G；

（2）在0.2ml的PCR反应管中加入：目标PCR片段Xμl，浓度为20ng/μl的vector1μl，2×Reaction Buffer5μl，T4DNA Ligase(2u/μl)0.5μl，无菌去离子水补足到10μl

轻轻弹动反应管以混匀内容物，短暂离心3-5秒；

（3）将上述混合反应液放置在22℃-30℃中反应5分钟，反应结束后，将反应管置于冰上，进行后续的转化反应；

当插入片段长度大于2kb，可以将反应时间延长至30分钟；

（4）转化

a取部分连接产物加到50-100μl感受态细胞中（刚从冰箱里取出的感受态放于冰浴上约20分钟解冻，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30分钟；

b将离心管置于42℃恒温45-60秒，取出管后立即置于冰浴中放置2分钟，其间不要摇动离心管；

c吸取全部的转化产物加到含氨苄青霉素（氨苄青霉素终浓度100μg/ml）的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开；待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时；

（5）阳性克隆检测

a快速菌落PCR检测

挑取菌落直接进行PCR检测，按照下面反应条件进行PCR鉴定阳性克隆子:95℃3min预变性，循环内94℃30s变性，55℃退火30s，25个循环，72℃延伸Xs（1K/min）,PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后4℃保存;

b测序鉴定：快速菌落方法进行初步的鉴定后进行DNA序列的测定；本载体PCR各鉴定和测序引物序列如下：

F5'-AGACAGATCGCTGAGATAGG-3'

R5'-CGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG-3'。