[发明专利]一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法。

背景技术

国内外大量基础和临床研究证明免疫治疗与传统的手术、放疗、化疗相结合对肿瘤患者病情的控制、生活质量的改善和生存期的延长具有重要的作用，近来研究更发现非特异性免疫细胞可以杀伤肿瘤干细胞，防止肿瘤的复发和转移（R.Tallerico et al，The Journal of Immunology,2013,190（5）:2381–90）。目前国内外应用最多的非特异性免疫细胞治疗方法是CIK、DCCIK细胞治疗。

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine Induced Killer），是通过多种细胞因子在体外将人外周血单个核细胞诱导的免疫效应细胞，具有增殖能力强，对肿瘤的非MHC杀伤能力强的特点，与其它免疫细胞制剂相比具有细胞扩增数量多、抗肿瘤效果强而且毒副反应更小的优点。CIK细胞的制备方法和应用已有较多的文献和专利公开（高岱清，一种制备CIK细胞的方法，专利申请号201210365499.7）

在人体免疫系统中，DC细胞（树突状细胞）是最为重要的高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。

2001年，研究发现将肿瘤患者自体的DC细胞加入体外诱导的CIK细胞中，两种细胞可以互相促进成熟，并诱导出比同源CIK细胞增殖活性和肿瘤细胞杀伤活性更强的细胞群（Marten,A et al,J Immunother,2001,24(6):502-510）。我国科学家也开展了大量DC-CIK的共培养研究，证明DCCIK比CIK具有更强的细胞增殖率，并能分泌更多的IL12、IFNγ等细胞因子，对肿瘤细胞的杀伤活性也更为强大（Li，SJ et al，Zhonghua Zhong Liu Za Zhi.2007 Oct;29(10):733-7）。

现有的DCCIK培养技术需要从人外周血单个核细胞（PBMC）中分离出贴壁的单核细胞和悬浮的淋巴细胞分别诱导，等单核细胞诱导出的DC细胞成熟后再与悬浮的淋巴细胞共培养，该方法技术复杂，对操作人员的技术水平和熟练度要求也高，所以不适合用于大规模的稳定的技术推广。

发明内容

为了解决现有的DCCIK培养技术中，DC细胞需要从贴壁的单核细胞诱导成熟后再与CIK细胞混合所存在的操作繁琐、技术复杂的问题，本发明提供了一种简单、高效、易推广应用的DCCIK制备技术。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法。

本发明的第二个目的在于提供所述制备方法制备得到的人DCCIK免疫活性细胞。

本发明的第三个目的在于所述人DCCIK免疫活性细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种人DCCIK免疫活性细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）从人外周血中分离单个核细胞；

（2）将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入IFNγ、IL-2、抗CD3单抗、GM-CSF、IL-4，培养3-5天；

（3）加入TNFα，继续培养1-2天；

（4）加入IL-2，继续培养7-10天，即得DCCIK细胞。

根据本发明，所述步骤（1）中所述单个核细胞是采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法制备。

根据本发明，所述步骤（2）中所述培养基为无血清培养基。

根据本发明，所述步骤（2）中所述IFNγ的浓度为200-1000U/ml、所述IL-2的浓度为100-500U/ml、所述抗CD3单抗的浓度为10-50ng/ml、所述GM-CSF的浓度为500U/ml、所述IL-4的浓度为500-1000U/ml。

根据本发明，所述步骤（2）中所述单个核细胞的细胞浓度调整为1-2×10⁶/ml。

根据本发明，所述步骤（3）中所述TNFα的浓度为500-1000U/ml。

根据本发明，所述步骤（4）中所述IL-2的浓度为500-1000U/ml。

本发明的有益效果：本发明直接在单个核细胞中加入各种细胞因子和刺激因子组合，使DC细胞和淋巴细胞共同诱导，互相刺激成熟，既简化了操作步骤，减少实验耗材，又可缩短细胞培养的时间，同时规范化的实验流程技术容易掌握，便于临床推广应用。

具体实施方式