[发明专利]一种稳定的α-淀粉酶检测试剂及应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于临床测定血清和尿液中α-淀粉酶（AMY）活性的检测方法及试剂。 

背景技术

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）是最早应用于临床检验的一个酶，早在20世纪初，就用来诊断急性胰腺炎，但是血清和尿液中的α-淀粉酶测定，长期以来一直是最难标准化的分析法。 

α-淀粉酶能水解淀粉、糖原和其它葡萄糖聚合物的α-1，4-糖苷键。淀粉分子是由许多葡萄糖分子组成的带分支的大分子多糖，直链部分的葡萄糖单体通过α-1，4-糖苷键相连，分支处则以α-1，6-糖苷键相连，因此，淀粉经α-淀粉酶可水解生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽寡糖及糊精的混合物。大多数淀粉含20~28%的直链淀粉和72~80%的支链淀粉。 

血、尿α-淀粉酶（AMY）测定在临床上的应用已有很长的历史，到目前为止，测定方法已不下200种。应用于淀粉酶测定的底物种类繁多，早期的测定方法所采用的底物是淀粉，六十年代出现了以染色淀粉为底物的测定方法，由于淀粉结构组成的不确定性及酶解产物的不均一性，使酶促反应不能按化学式量进行计算。应用不同来源、厂家、批号的淀粉作底物时，测得结果差别较大，方法不易标准化。染色淀粉中色素的加入量不易控制，操作繁杂，不适合自动分析。七十年代后期，国外出现了以具有明确结构组成的人工合成底物进行α-淀粉酶测定的方法，这些方法成为现在检测α-淀粉酶的主流，但是各个方法也存在着一些弊端，IFCC批准了用亚乙基封闭的G7-PNP作底物的酶偶联法(EPS法)作为临时推荐方法， 但该法需工具酶， 并需多步水解完成，延迟时间长，这不是最理想的参考方法。使用2- 氯-4- 硝基苯- 麦芽三糖(G3-CNP)作底物直接测定淀粉酶也有多篇文献报道，该法延滞时间较短，CNP的摩尔消光系数不易受pH的影响，G3-CNP 法更符合IFCC提出的理想AMS测定方法的条件，但因受内源性葡萄糖苷酶的干扰，被IFCC拒绝成为参考方法。 

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测α-淀粉酶的试剂及方法，本发明以2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP)为底物，在非还原性末端用半乳糖代替葡萄糖，从而避免了内源性葡萄糖苷酶的影响，使用2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷(Gal-G2-CNP)作为底物，不需要再加工具酶，延滞时间较短，反应产物CNP的摩尔消光系数不易受pH的影响，用半乳糖修饰麦芽寡糖苷的非还原端残基，阻止底物的非特异性水解，底物的稳定性显著提高。同时加入一些防腐剂、离子类以及一些易溶的表面活性剂，增强了溶液的稳定性，使试剂达到临床应用要求。 

本发明的技术方案如下： 

一种稳定的α-淀粉酶检测试剂，包括体积比为4:1的缓冲液和底物液，

所述缓冲液的组成为：

pH7.0MES缓冲液             50-200mmol/L

        NaCl                                  60-100 mmol/L

        CaCl₂                                                  10-20 mmol/L

        防腐剂   NaN₃                         1-10g/L；

所述底物液的组成为：

pH7.0MES缓冲液                      50-200mmol/L

        2-氯-4-硝基苯-麦芽糖苷      30-50 mmol/L

        防腐剂   NaN₃                       1-10g/L；

所述MES缓冲液的pH值范围为6.5-7.5；

进一步的，所述缓冲液和底物液中还包括十二烷基苯磺酸钠 1-20g/L。

本发明采用如下步骤检测α-淀粉酶的活性：按配比配制缓冲液和底物液；采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，将缓冲液和底物液按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、朗道标准品和样本，先通过检测蒸馏水和朗道标准品获得标准品检测的吸光度变化，根据朗道标准品AMY试剂的靶值（105U/L），得到试剂的K因子，之后根据全自动生化分析仪测定的样本的吸光度，获得样本的α-淀粉酶浓度。