[发明专利]一种酶固定化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学、检验检测领域，涉及一种酶的固定化方法。 

背景技术

酶的检测在医学、环保、军事、农业等众多领域均具有重要用途。但由于游离酶性质不稳定,极易失活,不能重复使用,只有固定化酶才具有使用价值。因此，酶的固定化技术决定着酶传感器的灵敏度,稳定性和选择性及有无实用价值。 

酶的固定化方法主要有吸附法,包埋法,交联法和共价法。吸附法指的是活性酶在载体表面上的吸附，包括物理吸附和离子吸附，固化过程不需化学试剂，对酶的活性影响小，具有操作简单、步骤少、物理吸附具有很少发生酶降解等优点，但固定后的酶易从载体上脱落，存在稳定性和重现性差，且生物酶存活时间短等问题，因此不能被广泛应用。包埋法是将酶包埋在高分子聚合物三维空间网状结构中的固定方法。该方法可采用温和的实验条件；酶易于渗入聚合物薄膜，且不产生化学修饰，对酶的活性影响甚小；薄膜孔径和几何形状易于控制；包埋的酶不易泄露，同时还能用其它辅助固定技。但这种固定化技术也存在局限性，如聚合物形成过程中产生的自由基对酶的活性基团有影响，而使酶的活性降低。交联法是指通过双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与凝胶、聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定的方法，最常用的交联剂是戊二醛，这种方法的缺点是膜的形成条件不易确定，须仔细地控制pH、离子强度、温度及反应时间等条件。共价法是指酶分子通过共价键与载体表面结合而固定的方法，这种方法虽然使酶的结合力增强了，但是存在酶的活性基团因参与共价反应而导致酶活性明显降低的问题。 

由于存在上述问题，本领域亟需一种既能使酶保持较高的活性，同时又有很好的稳定性且简单方便的酶固定化方法。 

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种采用过滤法进行酶固定的方法。该方法利用微孔滤膜吸附性强和形成大量空间网状结构的特点，使酶牢固地结合在膜上，既保证了固相酶的活性又保证了其稳定性。 

本发明的第一方面涉及一种酶固定化方法，所述方法包括应用过滤或其类似方法使酶固定在微孔滤膜或其类似物上的步骤。 

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的酶为可以将其固定在微孔滤膜或其类似物上的任何酶，例如为乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、有机磷化合物水解酶、单胺氧化酶、凝血酶或β-分泌酶等，在本发明的一个实施方案中所述酶为乙酰胆碱酯酶。在本发明的另一个实施方案中，所述酶为凝血酶。 

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的乙酰胆碱酯酶可以是纯化的乙酰胆碱酯酶，例如从电鳗中纯化的酶，也可以是来源于红细胞、膈肌组织、肌肉组织或脑组织的乙酰胆碱酯酶。在本发明的一个实施方案中，所述乙酰胆碱酯酶来源于红细胞。所述红细胞可以为人的红细胞，也可以为动物的红细胞，例如犬的红细胞。在本发明的另一个实施方案中，所述乙酶胆碱酯酶来源于电鳗。 

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中当所述乙酶胆碱酯酶来源于红细胞时，在将酶固定之前还包括将红细胞裂解的步骤。 

其中所述将红细胞裂解可以采用水或其它溶液，例如低渗盐溶液、Tris-HCl溶液或含有表面活性剂（如Triton X-100）的溶液。 

在本发明中，通过将红细胞裂解后再过滤，可以去除血红蛋白对显色结果的干扰，使酶活性的测定更加准确。 

在本发明中，其中所述过滤或其类似方法可以采用本领域常用的过滤方法，例如包括重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤等。 可根据酶和微孔滤膜的性质选择合适的过滤方法和过滤条件，以使含有酶的溶液通过微孔滤膜，并将酶固定在微孔滤膜上。