[发明专利]树鼩IL-6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种树鼩IL-6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对树鼩IL-6基因片段的克隆并测序，

（2）以克隆的树鼩IL-6基因片段为目标，设计TAQMAN PCR引物和探针，

（3）设计实验得到引物的退火温度、引物浓度和探针浓度，并提纯树鼩IL-6质粒计算IL-6基因片段拷贝数，

（4）以计算好的树鼩IL-6质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为10⁵ ～10⁸copies 阳性质粒建立标准曲线，

（5）验证本方法的重复性、稳定性和灵敏性。

2.根据权利要求1所述的树鼩IL-6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤（1）所述克隆为以经ConA（Concanavalin）诱导培养的树鼩淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法克隆出树鼩IL-6 cDNA片段，将该片段纯化后，通过T-A克隆连接到PMT-19T质粒中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中进行扩增，筛选并提取阳性克隆子进行纯化，获得树鼩IL-6分子测定的外参照阳性质粒。

3.根据权利要求1所述的树鼩IL-6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤（2）所述引物和探针为：

IL-6 FP：5'– GACAGTATTTACAAGTGCAGGGT–3'

IL-6RP：5'– TCCAAAAGACCAGTGATGATTC–3'

IL-6Probe：5' (FAM)–ACTGGCAAAAAACAATCTGAACCTTC-(TAMRA)3'。

4.根据权利要求1所述的树鼩IL-6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤（3）所述实验为：

A.退火温度的确定：

      根据本引物和探针特点分别设计退火温度55℃、56℃、57℃、58℃以确定其最佳退火温度，以PMD-19T IL-6质粒为模板应用PCR仪进行梯度扩增：dream Mix Taq酶 25uL、dH₂O 22uL、Tupaia-IL-6 FP/RP各自1uL、模板1uL，混合均匀；95℃ 3min；95℃ 30s，55～58℃ 30s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 10 min；扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，以58℃条件下电泳条件最清晰，条带位置正确，无非特异扩增，因此确定退火温度Tm=58℃；

B.引物浓度的确定：

引物浓度：以相同条件下能够检测到的模板浓度最低，扩增产物条带单一、清晰为引物选择标准；以100nm、200nm、500nm  3个不同浓度的IL-6 Taqman PCR上下游引物浓度，分别用同一浓度IL-6重组质粒为模板，共分为3个反应体系列组，同时进行RT-PCR扩增；反应体系为25uL:Realtime PCR Master Mix 12.5ul、Tupaia-IL-6 FP/RP 各自1ul、DEPC处理水8.5ul、模板2ul混合均匀；95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 30s, 72℃ 1min, 35个循环；72℃ 10min扩增，4℃备用；扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，不同引物浓度下电泳显示：引物200nm为最低浓度；

C.探针浓度的确定：

以相同模板浓度下循环阈值（Ct）最小、荧光信号比(Rn)活度最大为探针选择标准；采用50nm、100nm、200nm 3个探针浓度，分别用同一浓度IL-6重组质粒为模板，进行Taqman PCR检测；反应体系为25uL:2X One Step RT-PCR Buffer Ⅱ 12.5uL、Takara Ex Taq HS 0.5uL、Primer Script RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5uL、Tupaia-IL-6 FP/RP各自0.5uL、Probe溶液0.5uL、模板1uL、Easy dilusion 9uL，混合均匀；95℃ 3min；95℃ 10s，X℃ 30s，40个循环；72℃ 5分钟，4℃保存备用；观察扩增曲线和检测报告，通过不同探针浓度扩增曲线和Ct值显示，该检测体系在200nm条件下Ct值最小，Rn最大扩增曲线良好。

5.根据权利要求1所述的树鼩IL-6构建的质粒为标准品的TAQMAN探针实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤（3）根据以下公式计算拷贝数：

拷贝数（copies/m）=质量浓度（ug/uL）×阿氏常数/质粒分子量，其中，阿氏常数为6.02×1023；质粒分子量=一个碱基对的分子量（649）×重组质粒总长度（bp）。