[发明专利]一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，具体涉及一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法。

背景技术

胰腺是人体重要的内、外分泌器官，位于腹上区和左季肋区的腹膜后面，分为内分泌部和外分泌部两部分。外分泌部由导管（导管细胞的标志分子CK19）和腺泡构成，可合成并分泌淀粉酶（amylase）、脂肪酶等。内分泌部分散在外分泌部之间，主要由A细胞、B细胞、D细胞和PP细胞组成，分别分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑素和胰多肽。目前急性重症胰腺炎、慢性胰腺炎和胰腺癌的治疗十分棘手。而研究胰腺外分泌细胞在体外的分化及发育过程，可能为研究胰腺疾病的发生机制提供新思路，为研究胰腺损伤提供新的治疗方法。

干细胞具有强大的自我更新及多向分化潜能，为多种疾病的治疗提供了一种新的手段。干细胞根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是指着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞。ESC具有增殖、自我更新和强大的多向分化能力，在体内、外可以诱导分化为几乎所有的组织细胞。1981年Evans等分离小鼠胚胎干细胞，建立小鼠的胚胎干细胞系。研究表明小鼠ESC在去除LIF的培养基中可以形成胚体(embryonic bodies,EBs),分化为外、中、内胚层，内胚层包括定型内胚层和脏内胚层。定型内胚层起源于前原肠胚，随着胚胎的发育形成原始消化道及与消化道相关的脏器组织，比如胰腺、肝脏等。因此定型内胚层可以作为胰腺细胞、肝细胞及肠道上皮细胞的前体细胞群，进行体外定向诱导分化的研究。近年来，研究胚胎干细胞在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及胰岛样细胞较多，研究分化为胰腺外分泌细胞的报道甚少。在Gouon-Evans V等人的研究中，以ESC来源的定型内胚层为前体细胞，通过BMP-4的诱导，成功在体外获得可以产生甲胎蛋白（AFP）及白蛋白的肝脏样细胞，这一研究成果为以定型内胚层作为诱导分化的前体阶段，实施胰腺前体细胞及胰腺内外分泌细胞的定向诱导分化提供了实验基础。

信号通路在干细胞增殖分化中扮演了重要的调控角色。多个研究报道显示，在ESC体外形成EB的自然分化过程中可以形成一定比例的定型内胚层。研究表明，在胚胎发育过程中，激活Nodal通路及抑制Shh通路可以诱导及促进胰腺细胞、组织的分化和发育。因此调控Nodal通路和Shh通路，为ESC体外诱导分化定型内胚层细胞，进一步诱导分化为胰腺组织样细胞提供了有效途径；为ESC体外诱导分化为胰腺组织样细胞修复胰腺损伤提供实验基础。

发明内容

本发明的所解决的技术问题在于提供一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法，通过诱导胚胎干细胞分化为内胚层细胞，然后通过进一步诱导使其分化为胰腺前体细胞，随后进一步分化为可以分泌淀粉酶的胰腺组织样细胞。

为此，本发明提供一种诱导胚胎干细胞为胰腺组织样细胞的方法，包括如下步骤：步骤一、采用悬滴培养法使胚胎干细胞分化为三个胚层细胞，并使用免疫磁珠细胞分选法（Magnetic active cell sorting,MACS），纯化出定型内胚层细胞；

步骤二、利用定型内胚层细胞，进一步诱导使其分化为胰腺前体细胞；

步骤三、使胰腺前体细胞在体外进一步分化，形成较高淀粉酶分泌能力的胰腺组织样细胞。

其中，所述步骤一是采用悬滴培养法使小鼠胚胎干细胞分化为三个胚层细胞，并使用定型内胚层的特异性标志物标记的磁珠分选纯化出定型内胚层细胞；步骤三中胰腺组织样细胞为胰腺外分泌细胞。

步骤二、利用定型内胚层细胞，进一步使其分化胰腺前体细胞；

步骤三、使胰腺前体细胞，在体外进一步分化，形成较高淀粉酶分泌能力的胰腺外分泌细胞。

优选地，所述小鼠胚胎干细胞为E14TG2a系小鼠胚胎干细胞。

优选地，所述定型内胚层的特异性标志物为CXCR-4-分子。

优选地，所述步骤二中是通过使用环杷明（Cyclopamine）及Exendin-4联合诱导，使定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞。

优选地，所述步骤二中环杷明和Exendin-4在培养基的浓度为1.0uM和10nM。

优选地，所述步骤一的悬滴培养过程中包括：

使小鼠胚胎干细胞在去除白血病抑制因子的培养基中可以形成胚体；

而后在无血清培养基中培养分化成三个胚层细胞，所述无血清培养基中添加有对定型内胚层分化起促进作用的诱导剂Activin A。