[发明专利]霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺及所用新型氮源

说明书

技术领域

本发明涉及甾体激素类药物霉菌发酵领域，具体为一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺及所需新型氮源。

背景技术

环氧黄体酮呈白色结晶粉末状，无臭，溶于甲醇，甲苯等有机溶剂。由天然甾体薯蓣皂素经过开环、乙酰化、氧化、水解、消除、环氧化、氧化等反应制得，廉价易得，是我国用量最大的一类非常重要的甾体药物中间体，广泛应用于肾上腺皮质激素药物的合成，是氢化可的松、可的松、强的松，地塞米松和肤轻松等甾体激素类药物的主要原料。

1952年，美国普强制药公司的Murray等首次利用黑根霉将黄体酮转化为11a一羟基黄体酮，解决了皮质激素合成中的关键问题，且转化率有90%以上，反应专一性强，是化学方法无法比拟的，使得人们开始认识到微生物转化在甾体药物生产中的重要性。随后，研究者又相继发现了细菌、放线菌、酵母和霉菌的某些菌种可使甾体化合物的特定部位发生有价值的转化，许多化学方法难以进行的反应，利用微生物转化可以轻而易举地实现，从而促使了生物催化和生物转化这一新领域的兴起，也促进了甾体药物工业的迅速发展。

黑根霉微生物转化，是指利用黑根霉细胞(酶)对沃氏氧化物C11位(基团)进行特定的羟化反应，使其转化成结构上相类似的更有价值的新化合物霉菌氧化物。其转化的最终产物不是黑根霉细胞对营养物质的代谢产物，而是黑根霉细胞酶系对底物的C11位进行催化反应后的产物。由于采用微生物转化法能够减少合成步骤，缩短生产周期，提高收率，减少副反应，而且反应迅速、专一，条件温和，有立体选择性和区域选择性，因此利用微生物转化具有重要的现实意义。目前，微生物转化技术，如羟化反应已成为许多甾体激素药物或其中间体合成路线中不可或缺的关键技术。

甾体微生物转化过程中一个重要的技术难点是如何提高转化效率，该过程存在氮源中蛋白质含量偏低，氨基酸组合配伍不够合理，尤其是铁离子含量低及存在可溶性磷离子等诸多缺陷，虽多年来工艺不断改进，各项指标有所提高，但其转化率、收率、指标并无大的突破。

发明内容

本发明针对以上不足之处，提供了一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺及所需新型氮源，它是针对现有技术不足的一种改进，它是采用新型氮源弥补蛋白质含量偏低，氨基酸配比不够合理等缺陷的生物发酵工艺；它在保证现有产品质量的前提下，大幅度提高产品转化率、收率指标的重大突破，这是多年来各种改进所不能达到的。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺，它包括以下步骤：

（1）菌丝制备：

A、将碳源：葡萄糖60～85kg；氮源：玉米浆40～57kg；蚕蛹粉10～20kg；硫酸铵5～10kg；新型氮源，新型氮源各组分在培养基中的终浓度设置为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH₄)₂SO₄ ：0.5‰，FeSO₄·7H₂O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH₂PO₄ ：1‰，MgSO₄·7H₂O： 0.2‰，吐温80 1%；消沫剂：聚醚1000～2000mL一次投入到一级发酵罐内，加入1～4吨水，调整pH值至2～5，蒸汽灭菌，降温至27±3℃时，接入黑根霉的孢子悬浮液3～50升，孢子悬浮液浓度为10～300万/mL,通入空气，所说的通入空气和反应液的体积比为0.21～0.28倍体积/min，搅拌12～36h,后移入二级发酵罐；

B、按与一级发酵罐同样的物料配比投5～10倍物料，经灭菌，降温至27±3℃，移入A步骤所制全部液体，通入空气，所说的通入空气和反应液的体积比为0.21～0.28倍体积/min，搅拌18～36h，投入340kg底物沃氏氧化物，于25～30℃进行生物氧化，氧化反应时间为24～72小时，取样镜检，及色谱测试，底物转化比例达到50～60%后，提高温度至30～60℃，下口罐放料；

C、将菌丝液体压入板框压混机，滤掉发酵液，将菌转体空气吹干，再将菌转体粉碎；

（2）霉菌氧化物粗品的制备：将粉碎后的菌丝体投入提取罐内，加入菌丝体重量5～10倍丙酮，提取2～8次，将提取液浓缩结晶，得霉菌氧化物粗品；