[发明专利]荧光定量PCR检测醋醅中五种菌的方法

权利要求书

1.一种应用荧光定量PCR检测醋醅中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的方法，其特征及具体步骤如下：

①设计、合成针对瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）和嗜酸乳酸菌（Lactobacillus acidophilus）的特异性引物；

②对分离纯化得到的瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行摇瓶培养，利用细菌提取试剂盒分别对其培养液进行DNA提取；

③分别以瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的DNA为模板，以Lhe-F/Lhe-R、Lcr-F/Lcr-R、Lca-F/Lca-R、Lde-F/Lde-R和Lacid-F/Lacid-R为引物进行PCR扩增，获得目的片段，并将PCR产物割胶回收；

④构建重组质粒，将目的片段与pMD19-T Vector 连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子扩大培养，提取质粒，并用PCR验证目的片段是否插入pMD19-T Vector，验证成功的质粒作为荧光定量PCR的标准样品；

⑤利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品；

⑥荧光定量PCR反应体系和反应条件；

⑦重组质粒倍比稀释8个梯度，与待测样品同时进行荧光定量PCR，根据标准样品的拷贝数与CT值建立标准曲线，然后通过标准曲线和待测样品的CT值对醋酸发酵过程不同时间醋醅群落中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行定量分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤①的特异性引物为：

。

3.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤⑤所述的利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品的方法具体操作为：

称取2 g 醋醅，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50 mL 离心管；向离心管中加入6 mL DNA 抽提缓冲液，再加入100 μL 溶菌酶（50 mg/mL），于225 rpm摇床上37℃摇动30 min；向离心管中加入 1.5 mL 10% SDS，65℃水浴2 h，每隔 15～20 min 轻轻颠倒几下，室温 6000×g 离心10 min；收集上清；将上清液用等体积的氯仿-异戊醇（24:1体积比），抽提一次，以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1h, 16000g 离心20 min, 收集核酸沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100 μL TE或ddH₂O中，加入终浓度为0.5 μg/ml RNaseA, 并在37℃下水浴消化2 h,以去除RNA, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的效果，如果在10 kb左右出现条带，则DNA提取成功，将成功提取的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤⑥确立的荧光定量PCR反应体系和反应条件如下：

反应体系采用20 μL体系，其中SsoFast EvaGreen 预混液10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板DNA10 ng，ddH₂O加至20 μL；反应条件为95℃预变性 30 s；95℃变性5 s，最佳退火温度10 s，读取荧光信号数据，共循环扩增40次。