[发明专利]一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法

权利要求书

1.一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法，包括以下步骤：（1）菌株活化培养；（2）菌株菌丝固体培养；（3）液体菌丝体培养；（4）菌丝体酶解；（5）原生质体亚硝基胍（NTG）诱变；（6）原生质体再生培养；（7）再生菌继代培养；（8）发酵培养；（9）过滤得到菌丝体；（10）遗传稳定性测定；

其特征在于：

（1）菌株活化培养 将实验室保藏的蛹虫草菌株转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养，23-26℃恒温静置培养4～5d；按照如上方法菌株活化2次；PDA固体斜面培养基同菌丝固体平板培养基，其配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH₂PO₄ 2g，MgS0₄?7H₂O 1g，琼脂粉15g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min；

（2）菌株菌丝固体培养 从活化好的斜面试管上刮取培养好的菌丝体接种于蛹虫草菌丝固体平板培养基中，23-26℃恒温静置培养6～8d；菌丝培养好后，用于接种液体培养基；

（3）液体菌丝体培养  从培养好的菌丝固体平板培养基上取菌丝块接种到装有30 mL菌丝培养基的250mL锥形瓶中，23-26℃，160 r/min进行恒温震荡培养2-3d；

菌丝液体培养基配方：葡萄糖30g、蛋白胨8g、(NH₄)₂S0₄ 6g、KH₂P0₄ 1.6g、MgS0₄?7H₂0 0.5g、FeS0₄?7H₂0 0.03g、酵母粉4g，加水定容至lL，pH 6.8，121℃灭菌20min；

(4) 菌丝体酶解  a.原生质体制备：将MgS0₄?7H₂0、甘露醇溶解于双蒸水中配制成浓度为0.6 mol/L的渗透压稳定剂溶液，高压灭菌后备用；

b．配制裂解酶液：分别称取蜗牛酶及纤维素酶，溶解于0.6mol/L的渗透压稳定剂中，使两种酶的浓度分别达到0.6%和1.2%(W/V)，0.22nm微孔滤膜过滤除菌，然后按照2:1的体积比混合备用；培养好的菌丝体无菌滤纸过滤，并置于无菌离心管中，用以上渗透压稳定溶液洗涤3次，将多余的水分用无菌滤纸吸干，按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入1.5mL酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于26℃摇床上50r/min缓缓震荡孵育2-4h，中间用移液枪轻轻吹打悬浮；酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000-4000r/min离心5-8min，温和地沉淀原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用；

（5）原生质体亚硝基胍NTG诱变  用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为2 mg/mL；取1 mL NTG处理液与稀释成一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床，转速80r/min，26℃处理10-60min后，将处理液3000-4000r/min离心5-10min，弃去上清，用pH6.5，0.1M的无菌磷酸缓冲液洗涤菌体2~3次，终止反应；

（6-7）原生质体再生培养及再生菌继代培养 诱变后的原生质体进行系列梯度稀释，吸取200μL/皿涂布于再生固体培养基平板上进行再生培养；

原生质体再生培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨4g，酵母粉5g，KH₂P0₄ 2g，MgS0₄?7H₂0 1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，水1000 mL，pH6.8，121℃灭菌20min；培养条件为：23-26℃避光恒温培养6-8d；将在原生质体再生培养基上生长较快的菌落接到菌丝固体平板培养基上，23-26℃恒温培养4-6d，得到第一代诱变菌株；再将第一代诱变菌株接到以上培养基中，按照第一代培养的方法培养得到第二代诱变菌株；继续转接得到第三代诱变菌株；

（8）发酵培养 获得的第三代诱变菌株接种到液体发酵培养基中（30mL／250mL三角瓶)，23-26℃ 160r/min震荡培养2-3d，然后按照6%的接种量接种种子液到发酵培养基中（100ml/1000ml三角瓶）（液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20g、葡萄糖20g、蔗糖10g、大豆蛋白胨15、硫酸铵8g、酵母提取物6g、KH₂P04 0.8g、MgS0₄?7H₂0 0.75g、ZnS0₄?7H₂0 0.08 g、FeS0₄?7H₂0 0.04g、VB1 0.18g，加水定容至1L，pH 6.8，121℃灭菌20min），23-26℃ 160r/min震荡培养4-6d；

（9）过滤得到菌丝体，进一步冲洗菌丝，测定菌丝体虫草素含量，将产虫草素含量较高的菌株保藏；

（10）遗传稳定性测定 发酵获得的菌丝体冷冻干燥，粉碎过60目筛，制备供试样品；称取蛹虫草菌丝体干粉0.1g，加入5mL蒸馏水，超声破碎20min，80℃水浴浸提3h，8000g/min离心10min，取上清测定菌丝体虫草素含量。

2.根据权利要求1所述的一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法，其特征在于：所述的发酵液中的虫草素含量测定方法：样品适当稀释，0.45 m微孔过滤后HPLC测定；

采用HPLC法测定蛹虫草菌丝体中虫草素含量，使用日本岛津公司的高效液相色谱仪，大连依利特的Hypersil C18分析柱，5μm，4.6mm×250mm，Sigma公司的虫草素标准品；上机条件：流动相0.01mol/L的KH₂PO₄:甲醇 =90:10，检测波长：258nm；流速：0.8 mL/min 柱温：40℃，进样量20μl，虫草素对照品浓度：4 mg/L；

样品浓度=（样品峰面积/标准品峰面积）×标准品浓度×稀释倍数。