[发明专利]一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽

说明书

技术领域

本发明属于医学基础研究领域，具体的说，涉及一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽。

背景技术

慢性粒细胞白血病是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，它的特点是产生大量不成熟的白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。而由t(9；22)(q34；q11)形成的Bcr-Abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病(CML)的主要特征，其异常激活Abl蛋白激酶会引起血细胞恶性增殖、凋亡减少等一系列变化。STI571可以特异性抑制Abl激酶，作为CML的经典治疗药物，广泛应用于临床，大多数病人的病情得到控制，但当Abl激酶活化位点发生突变后就会产生STI571耐药而导致复发。

研究表明Abl激酶的活化需要Bcr_1-72单体形成反向平行的同源二聚体再形成同源四聚体。从晶体结构的研究中可知Bcr_1-72单体主要由a1螺旋(5-15位氨基酸)，a2螺旋(28-67位氨基酸)及a1、a2之间可变的环状区(16-27位氨基酸)组成。其中Bcr_30-63是最关键的部位。

因此，在前期设计CTP-OD-HA融合蛋白的基础上，将OD分成两个部分，一部分为30-63位氨基酸，定义为OD2，其余部分1-29位和64-72位拼接在一起定义为OD1，并将其分别与一种新近报道的能携带蛋白类大分子穿越细胞膜并定位于细胞浆中的新型转导肽CTP连接。使用pCOLD-TF-DNA原核表达载体，可以高效表达可溶性的外源性融合蛋白，作为携带胞浆蛋白治疗肽的穿膜系统，可以使CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合蛋白定位在胞浆，与细胞中的Bcr-Abl融合蛋白的单体形成反向平行的异源二聚体后再形成异源聚体而抑制Bcr-Abl激酶的活性使细胞调亡增加，增殖减少。但是，其中TF-CTP-OD2-HA在使用时需要的浓度高(60μmol/L)，易降解，因此产生的生物学效应持续时间短。

现有技术的缺点：现有的治疗CML的药物中，OD2需要连接转导肽CTP才能进入细胞，而且使用药物的浓度大，稳定性低，容易产生耐药性，导致疾病的复发。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种不连接转导肽CTP就能使OD2穿过细胞膜进入细胞，可以抵抗蛋白酶的降解、小分子量较小的稳定性高的杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽。

本发明目的是这样实现的：

一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽的课题思路为：

研究表明，OD2的结构是α-螺旋，BCR_1-72晶体结构中各氨基酸对于其自身螺旋结构稳定性的作用中发现，第38，52，54，57位氨基酸是螺旋结构中最重要，其突变后将不能维持自身螺旋结构，而第41，45，60位氨基酸被其它氨基替换后会使其螺旋结构更加紧密，而第47和51位氨基酸的改变对螺旋结构不影响，(请参见：Christina M.Taylor and Amy E.Keating.Orientation and Oligomerization Specificity of the Bcr Coiled-Coil Oligomerization Domain.Biochemistry.2005,44(49):16246–16256.)因此将OD2结构的第30-63位氨基酸缩减为第34-60位，有利于通过化学修饰的方法增加OD2结构的稳定性，而在目前存在的多种化学修饰方法中，以烯烃键的修饰增加a螺旋的稳定性并使其本身具备穿膜能力而最为显著。

本课题组在OD2本身结构是a螺旋的基础上，在a螺旋肽的i，i+4位插入S型的含戊烯支链的甲基化的a，a-二取代甘氨酸，通过烯烃闭环复分解反应(ring close metatiesis，RCM)将两个非天然氨基酸侧链戊烯基的碳原子连接形成C=C双键，就像是钉书钉(staple)一样稳定其螺旋结构，使OD2顺利穿过细胞膜进入细胞而不被蛋白酶降解，与Bcr-Abl寡聚化区域形成异源二聚体，从而抑制其同源二聚体的形成；异源二聚体抑制其自身四聚体化，进而抑制Bcr-Abl激酶的活化；Bcr-Abl激酶被抑制后导致细胞凋亡增加，增殖减少，如图1所示。

根据以上思路按以下步骤进行了实际操作：

1、化学烯烃修饰OD2结构