[发明专利]大豆小RNA基因gma-miR169d及其在干旱调控中的应用

说明书

技术领域：

本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及一个大豆抗干旱大豆microRNA基因gma-miR169d，及其在抗旱调控中的应用。

背景技术

植物在生长过程中受到生物和非生物类的逆境胁迫，其中干旱是植物正常生长重要限制性因素之一。干旱会引起植物原生质体脱水，改变细胞膜的结构与透性，最终导致农作物产量降低。植物在干旱的过程中，通过关键基因的调控抵御或防卫干旱带来的不利影响。利用抗性基因资源改良植物的抗旱性，是提高农作物产量的有效方法。

植物对环境变化作出应激反应是基因水平调控和表观遗传调控的共同结果。microRNA分子作为一类非编码小分子，直接参与植物的生长、发育及对胁迫环境的耐受性。成熟的miRNA通过与靶mRNA的特定位点结合，引发mRNA的降解或抑制翻译来介导作用靶基因的转录后沉默。microRNA作为细胞逆境应答的激活因子出现，特异的回应逆境胁迫。有研究指出玉米在盐胁迫下，高粱在干旱胁迫下均涉及大量microRNAs表达水平改变。大豆受干旱胁迫的microRNA基因调控研究亦是增强或改善大豆抗逆的焦点。

MiRNA169是对干旱产生应答的一个重要小RNA，在大豆中共有21个家族成员。根据研究发现，在干旱处理条件下不同植物miR169的表达具有差异。在水稻中，干旱处理下miR169g的表达下调，miR169g 和miR169n是一个小RNA簇以串联形式存在，两者距离是3707bp。在miR169n(o)基因的上游有ABRE脱落酸响应元件说明miR169n（o)可能受到ABA的调控。在干旱渗透胁迫下miR169g通过脱水响应元件DRE被诱导。NF-Y是一个可以和CCAAT box结合的一类蛋白复合体，是进化保守的转录因子。NF-Y核转录因子包括三个亚基，NF-YA，NF-YB，NF-YC，编码亚基的基因包含一个进化保守区域，负责和DNA结合。研究表明，番茄在受到干旱胁迫时Sly-miR169表达上调，所预测的三个靶基因（NF-YA1，NF-YA2，NF-YA3）的表达量明显下降，超表达Sly-miR169c番茄植株的气孔开放数量减少，降低了蒸腾作用叶片的水分损失率，抗干旱能力明显增强。

发明目的

本发明的目的是提供一种大豆干旱调控相关的microRNAs，大豆小RNA基因gma-miR169d。

大豆小RNA基因gma-miR169d，它包括碱基序列如序列表SEQ ID No.1和/或2所示的基因。

大豆小RNA基因gma-miR169d，它的碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示；

一种重组载体质粒，它是在RNA表达载体中插入大豆小RNA基因gma-miR169d；

所述的表达载体为pBASTA-RD，它是用多克隆位点接头替换pEGAD载体中的EGFP（Ala）₁₀ 基因序列构建而成；

所述的表达载体为p35S-NOS，它是用化学合成的MCS序列替换HBT-sGFP(S65T)-NOS载体PST I（3978）和Hind Ⅲ（3025）酶切位点间的C4ppdk1Zm-sGFP(S65T)序列构建而成。

大豆小RNA基因gma-miR169d在生产耐旱转基因植物中的应用。

本发明提供了大豆小RNA基因gma-miR169d，它是利用Solexa测序技术获得了的microRNAs，分析结果表明，大豆小RNA基因gma-miR169d与大豆干旱调控相关， 将含有gma-miR169d的成熟基因片段连接到载体上，并转入拟南芥，通过抑制拟南芥细胞内的靶基因的表达来进一步提高拟南芥对干旱的耐受能力。解决了转耐干旱基因操作涉及基因序列过长而遭遇转化困难等问题，该类干旱诱导的miRcroNA为小分子表达调控基因，且为大豆内源性microRNA，不编码产生蛋白。

附图说明

图1 HBT-sGFP(S65T)-NOS载体图谱；

图2 p35S-NOS载体图谱；