[发明专利]创伤弧菌和哈氏弧菌快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及两种细菌的快速检测方法，具体涉及创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）的检测方法。

背景技术

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）广泛存在于海洋环境中，是海水养殖动物常见的致病性弧菌，主要引起鳗鲡（Anguilla japonica）、石斑鱼（Epinephelus）、中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）、虹鳟（Salmo gairdneri）等养殖动物发病，可引起海水养殖动物急性败血症及组织功能衰退等病症，暴发性强，死亡率高，影响广泛，曾给海水养殖动物带来了较大的经济损失。创伤弧菌还是一种人与动物共患的致病菌，近年来在美国、韩国、日本等沿海地区引起数例急性败血病，也具有发病快、死亡率高，危害大的特点，引起社会广泛关注，据报道患者多为带伤作业或生吃了带菌海鲜引发急性感染。

海水养殖动物弧菌类病菌一但暴发，难于控制，因此在养殖过程中有必要进行病害监测，一但发现细菌性病害佂兆，及时诊断，然后采取相应防治措施，将病害消灭在萌芽状态，有效降低经济损失。可见，快速准确的诊断方法是把握最佳治疗时机的关键；本研究采用分子生物学检测中的双重聚合酶链反应（duplex polymetase chain reaction DPCR）的检测方法，通过设计及合成特异性引物，优化聚合酶链反应（PCR）扩增程序，建立了创伤弧菌和哈氏弧菌的双重PCR快速检测方法，是一种良好的特异性、敏感性，并具有省时、省力、快速和高效的检测方法，对提高海产食品安全和海水养殖动物病害防治具有积极意义。

创伤弧菌和哈氏弧菌的快速诊断方法，从公开报道所知，如：1.【题名】六种弧菌多重PCR快速检测方法的建立；【作者】李贵阳、肖鹏、郭养浩、莫照兰；【刊名】现代生物医学进展，2011 年23卷23期 4748-4752,4766页；【文摘】目的:检测鳗弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌六种水产常见病原菌。方法:以toxR-toxS为靶基因设计引物,建立了一种多重PCR(multiplex PCR,mPCR)快速检测方法。结果:本研究设计的mPCR引物特异性强,与其他弧菌及非弧菌无交叉反应,每次反应的敏感性为10-100 CFU(cell forming unit)/每个反应。2、【题名】快速检测哈氏弧菌的试剂盒及检测方法 ；【专利号】：03146928, 专利申请日：2003-09-25 ；【摘要】 本发明涉及检测哈氏弧菌的试剂盒及检测方法。试剂盒包括：（ａ）ＤＮＡ提取试剂：含缓冲试剂Ａ和细胞裂解试剂Ｂ，（ｂ）聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂Ｃ和反应引物试剂Ｄ，试剂Ｄ中的特异引物对ＶＰ↓［０１］为５′－ＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＡＡＧＣＣＧＣＴ、ＶＰ↓［０２］为５′－ＡＧＡＧＡＡＣＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＣＧ　　ＴＧＧＴＴＣ，（ｃ）电泳和显色试剂，包括试剂Ｅ和试剂Ｆ；检测方法包括（ａ）．样品处理，（ｂ）．ＤＮＡ提取，（ｃ）．ＰＣＲ扩增，（ｄ）．电泳和显色检测，在紫外光下检测有一条４８０核苷酸对条带的为有哈氏弧菌感染或污染，反之则没有。3. 【题名】用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒及方法 , 专利号：201210336013， 公开（公告）日：2012.12.26；【摘要】一种用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其组成为：反应液A，1支，其组成为：10×Lampbuffer，dNTP，硫酸镁水溶液，甜菜碱水溶液，引物vh-F3、vh-B3、vh-FIP、vh-BIP，BstDNA酶，10×荧光染料SYBRGreenⅠ，阳性对照试样，阴性对照试样和超纯水。本发明还涉及应用该试剂盒进行检测的方法。

以上检测方法都采用了现代先进生物学技术，能准确、便捷的诊断出相应弧菌类病原菌，但检测操作步骤多，诊断所需时间长。

发明内容

本发明的目的是为了有利于控制创伤弧菌和哈氏弧菌在海水养殖动物中传播与爆发，提供一种快速检测创伤弧菌和哈氏弧菌的方法，特别是提供二对创伤弧菌和哈氏弧菌特异性引物V₁ 和H₁ ，可应用于海产品及海水养殖动物创伤弧菌和哈氏弧菌的检测或监测，为两种弧菌快速诊断提供科学依据。