[发明专利]快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器及其制备方法

权利要求书

1.一种快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器，其特征在于，包括玻碳电极，玻碳电极表面修饰有一层多壁碳纳米管膜，多壁碳纳米管膜上依次修饰有RBP一抗、BSTA、RBP抗原和RBP二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器，其特征在于，所述RBP二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子是以SiO₂纳米粒子为核心，表面包覆Nafion膜，Nafion膜上吸附有Ru（bpy）₃²⁺，最外层标记RBP二抗的复合纳米粒子。

3.权利要求1或2所述的快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将SiO₂纳米粒子分散于Nafion-乙醇溶液中，冰浴中搅拌3-4小时，4℃下离心分离，获得Nafion包覆的SiO₂，记为NafionSiO₂；

2）将步骤1）获得的NafionSiO₂分散于pH=7.0～7.5的0.005～0.015M的PBS缓冲液中，加入RBP二抗，冰浴中搅拌5-6小时，离心分离，重悬于上述PBS缓冲液中，超声分散；

3）向步骤2）所得悬浮液中加入Ru(bpy)₃Cl₂，冰浴中搅拌50-60min，离心分离，得RBP二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子；

4）将RBP二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子分散于pH=7.0～7.5的0.005～0.015M的PBS缓冲液中，加入牛血清蛋白，4℃下保藏；

5）将酸化的碳纳米管分散在二甲亚砜中，加入EDC和NHS，室温下震荡3-4小时，离心分离；

6）将已活化的多壁碳纳米管分散到二甲亚砜溶液中，将上述分散液滴加到经预处理的玻碳电极表面，待电极表面晾干后，将RBP一抗滴加到多壁碳纳米管膜表面，35℃-40℃条件孵育1.5-2.5小时；

7）将BSAT溶液滴加到修饰有抗体的电极上，35℃-40℃条件孵育30-50分钟；

8）将该电极浸泡在RBP抗原中，35℃-40℃条件孵育0.5-1.5小时，得到固定的免疫交联层，记为RBP/BSAT/anti-RBP/MWCNTs/GCE；

9）将二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子滴加到修饰好的电极表面，35℃-40℃条件孵育0.5～1.5小时。

4.权利要求3所述快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤1）中SiO₂纳米粒子与Nafion的质量比为1:20-25。

5.权利要求3所述快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤2）中SiO₂与鼠抗RBP的质量比为1000:2.0-4.0。

6.权利要求3所述快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤3）中Ru(bpy)₃Cl₂与RBP二抗标记的NafionSiO₂中SiO₂的质量比4:1.0-2.0。

7.权利要求3所述快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤4）中牛血清白蛋白与RBP二抗标记的Ru–NafionSiO₂复合纳米粒子的质量比是1:2。

8.权利要求3所述快速高灵敏检测视黄醇结合蛋白的新型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤5）中EDC和NHS与酸化的碳纳米管的质量比为:25:25:1。