[发明专利]一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法

权利要求书

1.一种扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的引物组，其特征在于，包括有一个通用的逆转录引物和用于扩增HA、NA、M基因的引物对，其中逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，用于扩增A、NA、M基因的引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:2-7。

2.一种同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的方法，包括如下的步骤：

1）病原RNA的提取

取H9N2亚型禽流感病毒感染的阳性鸡胚尿囊液400μL，加入600μL细胞裂解液和400μL氯仿，颠倒混匀后，-20℃沉淀10min，15,000g离心10min；取上清加入到750μL异丙醇中，颠倒混匀，-20℃沉淀30min，15,000g离心10min；弃去上清液，用75%的冷乙醇洗2遍，弃去上清液，并吸干残余液体；

2）反转录

采用20μL的反转录体系：5×RT buffer4μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，200U/μL M-MLV反转录酶 0.5μL，25μmol/L的通用逆转录引物1.5μL，用DEPC水补足体积至20μL，42℃水浴1小时；

3）多重RT-PCR扩增HA、NA、M全长基因

采用总体积为30μL的多重PCR反应体系：10×PCR Buffer 3μL，25mM MgCl₂4μL，2.5mmol/L的dNTPs 5μL，Taq酶 0.5μL，基因上下游引物各0.5μL，RT产物2μL，用DEPC水补足至30μL，混匀离心后进行PCR，循环条件为94℃预变性 5min后，94℃变性30S，60℃退火40S，72℃延伸90S，共循环30次，最后72℃终延伸10min完成扩增。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的通用逆转录引物为权利要求1所述的逆转录引物。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的基因上下游引物为权利要求1所述的用于扩增HA、NA、M基因的引物对，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:2-7。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的HA全长基因为1742bp，NA全长基因为1410bp，M全长基因为1027bp。