[发明专利]一种硝酸盐转运体基因AtNRT1.1及其编码蛋白与应用

说明书

所属技术领域

本发明属于植物分子生物学与转基因相关技术领域。具体为拟南芥硝酸盐转运体(Nitrate transporters，NRTs)家族关键基因AtNRT1.1在低氮胁迫下的反应和作用机理，以及该基因在营养高效植物新品种培育中的应用。

背景技术

氮是植物必需的营养元素之一，是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素、酶等的组成成分。氮素供应不足会影响植物的生长发育，限制农作物的产量；而氮肥施用过量则使氮素利用率下降，不仅造成资源浪费，而且引起环境污染。通过挖掘植物自身遗传潜能，克隆耐低氮和氮素营养高效的基因，并利用转基因技术培育氮素利用效率提高的新品种是解决这一问题的重要途径之一。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科、芸薹属植物，它不仅是第一个完成基因组序列测定的模式植物(Athanasios Theologis.et al.，Nature，2000，408：791-826)，而且具有植株小，生长周期短，种子数量多，基因组小且易于进行遗传转化，自花授粉而又易于杂交等优点。因此在植物分子生物学及转基因相关技术领域中，拟南芥被作为模式植物广泛加以研究和应用。

硝酸盐转运体是一类专司硝态氮吸收、运输的转运蛋白。研究发现拟南芥中存在一个由53个成员组成的NRT1基因家族。已有研究表明AtNRT1.1为双亲和性硝酸盐转运体基因(Guo Fang-qing et al.，Plant Cell，2001，13：1761-1777)，参与对营养生长和生殖生长时期初生器官发育的调控。但至今还没有该基因在不同氮素浓度条件下对地上部分生长发育和氮素转运的报道。

发明内容

本发明提供一个拟南芥双亲和性硝酸盐转运体基因，以及该基因对不同氮素浓度的反应和生理机制。

所提供的硝酸盐转运体基因为ATNRT1.1(AT1G12110)。

上述基因具有SEQ ID No.1的碱基序列。

上述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。

ATNRT1.1基因的T-DNA插入突变体salk_138710是从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。

通过上述鉴定，获得ATNRT1.1基因T-DNA插入突变体salk_138710的纯合株系，并以之为材料进行不同氮素浓度处理，观察表型并拍照。然后对处理后的拟南芥幼苗进行根部及地上部含氮量的测量。

附图说明

图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果，结果表明所获ATNRT1.1基因T-DNA插入突变体株系salk_138710为纯合插入株系，其转录本被敲除。

图2显示野生型和突变体在无外源氮培养基上处理7天后的表型图片，结果表明突变体叶色比野生型绿且根长比野生型长，表现为耐低氮表型。

图3显示在0.1mM或5mM硝酸铵培养条件下处理3天后野生型和突变体根部和地上部含氮量差异，结果表明在0.1mM和5mM硝酸铵处理条件下，突变体根系含氮量高于野生型而地上部含氮量显著低于野生型(P＝0.0001)。

具体实施方式

下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。

1.拟南芥幼苗培养：

野生型和突变体种子分别用0.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，消毒后的种子放入4℃冰箱春化2天后点布于含1％琼脂的MS(Murashige and Skoog)固体培养基上，置于22℃光照培养箱中萌发生长。

2.纯合突变体的鉴定：

DNA提取：所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。取约0.5g拟南芥新鲜叶片，研磨成糊状，加400μl SDS提取液(0.5％SDS(W/V)；200mM Tris-Hcl，PH＝8.0；250mM NaCl；25mM EDTA)；12,000r/min，离心3min；取上清，加等体积异丙醇轻轻摇晃，静置30min；13,000r/min，离心5min；弃上清，用1ml95％乙醇冲洗1-2次后，自然风干，加去离子水30μl，4℃保存备用。