[发明专利]杂交瘤细胞株2D3、其产生的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株2D3、其产生的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮（ZEA）主要由禾谷镰刀菌产生，首先从有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖机能异常甚至死亡，可给畜牧场造成巨大经济损失。食用含赤霉病麦面粉制作的各种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45%，小麦的阳性检出率为20%。玉米赤霉烯酮具有残留性和不易被破坏性，如果家畜、家禽动物长期使用玉米赤霉烯酮污染的食品，玉米赤霉烯酮会不断地在体内积蓄，并沉积在动物体内。如果人食用了这种品质的畜产品，也会导致一些疾病的发生。为了保障消费者的食品安全消费，应开发有效的检测技术，对食用玉米、小麦等农产品及饲料用农产品中的玉米赤霉烯酮含量进行严格监管，以对玉米赤霉烯酮的污染情况做好监管和防控，保障人们的食品消费安全。

现有的对玉米赤霉烯酮的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。薄层层析法对玉米赤霉烯酮进行检测时，不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求玉米赤霉烯酮样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，其中，抗体作为免疫反应的核心试剂，为了建立针对玉米赤霉烯酮的免疫学检测技术，必须先制得抗玉米赤霉烯酮的抗体。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株2D3、其产生的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用。

本发明提供了杂交瘤细胞株2D3，该杂交瘤细胞株已于2013年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201328。其具有序列表中SEQ ID No.1所示的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID No.2所示的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。该抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体可以识别玉米赤霉烯酮，对玉米赤霉烯酮的50%抑制浓度IC₅₀为20pg/mL。

抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体在玉米赤霉烯酮含量测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株2D3是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经玉米赤霉烯酮完全抗原ZEA-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEA-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，然后采用ELISA方法分两步筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗玉米赤霉烯酮而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用玉米赤霉烯酮作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株2D3。

本发明提供的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将上述获得的杂交瘤细胞株2D3注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体。