[发明专利]人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用

说明书

 

技术领域

本发明属于基因工程抗体技术领域，尤其涉及利用噬菌体抗体库技术，筛选人源抗炭疽毒素保护性中和抗体Fab，用于制备炭疽病预防与治疗的药物。

 

背景技术

炭疽病（anthrax）是一种由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的急性传染病， 主要通过皮肤、呼吸道和消化道感染动物和人。炭疽芽孢杆菌在血液中可产生并释放两种炭疽毒素：致死毒素（lethal toxin， LeTx）和水肿毒素（edema factor， EF ）。炭疽致死毒素由：保护性抗原（protective antigen， PA ）和致死因子（lethal factor， LF）组成。保护性抗原（PA）与人体细胞膜蛋白结合，并Furin蛋白酶裂解成两个片段PA63和PA20。PA63分子连接形成七聚体，与EF或LF结合并进入细胞导致细胞死亡。在体外实验研究中，单独使用高纯度的致死毒素或水肿毒素可以使动物死亡或发生水肿。通过阻断保护性抗原与LF的结合或者PA与细胞膜受体的结合，可有效防止炭疽毒素的致病作用。因此，保护性抗原（PA）便成为炭疽病的理想治疗靶点。

本发明以保护性抗原PA63为靶分子，通过人源噬菌体抗体库的筛选，制备人源抗炭疽保护性抗原的中和抗体Fab（命名为PAFab），并对筛选获得的PAFab克隆进行表达、纯化以及功能鉴定。免疫学检测结果显示，该抗体能够与炭疽保护性抗原特异性结合，体外中和试验结果证实，该抗体能够有效阻断炭疽毒素的致病作用。

 

发明内容

解决的技术问题：本发明目的是提供一种人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用。

技术方案：人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，所述抗体的V_L链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.1所示的L-CDR1；

SEQ ID NO.2所示的L-CDR2；

SEQ ID NO.3所示的L-CDR3；

并且所述抗体的V_H链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.8所示的H-CDR1；

SEQ ID NO.9所示的H-CDR2；

SEQ ID NO.10所示的H-CDR3。

所述抗体的V_L链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，V_H链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述表达抗体V_L链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，表达V_H链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。

所述核苷酸表达的人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。

人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在治疗炭疽病中的应用。

本发明的目的是通过下列措施实现的：利用抗原固相筛选的方法筛选人源噬菌体抗体库（Fab抗体库）。经五轮筛选后，用酶联免疫吸附反应(enzyme linked immunosorbent assay，  ELISA)进行阳性克隆鉴定，筛选出人源抗炭疽保护性抗原（PA）的特异性抗体PAFab。经原核表达PAFab抗体，并用Protein L亲和层析柱纯化，纯化产物经ELISA进行分析和体外中和活性鉴定。

有益效果：该抗体能够特异性结合炭疽保护性抗原（PA），阻断致死因子合LF进入细胞内，从而发挥保护性作用。

 

附图说明

图1炭疽保护性抗原PA63融合基因在大肠杆菌系统中的表达，1、3：:细菌超声上清，2、4：细菌的超声沉淀，M：蛋白marker；

图2纯化的保护性抗原PA63 SDS-PAGE分析，1、3:非特异性洗脱，2：纯化的目的蛋白，M：蛋白marker；

图3噬菌体抗体库筛选的ELISA检测；

图4 诱导抗炭疽保护性抗原Fab表达的Western blot分析，M：Marker；1:阳性工程菌的超声上清；2: 阳性工程菌的超声沉淀；

图5 纯化的抗炭疽保护性抗原Fab (PAFab) SDS-PAGE分析，M：Marker；1:纯化的Fab；