[发明专利]基于液相芯片检测传染性造血器官坏死病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及基于液相芯片检测传染性造血器官坏死病毒的方法。

背景技术

传染性造血器官坏死症（IHN）是被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病，是《中华人民共和国动物防疫法》规定的三类疫病，是国际兽疫局OIE名录中的重要疫病。

鱼传染性造血器官坏死症是由传染性造血器官坏死病毒（IHNV)引起的。IHNV为RNA病毒，是弹状病毒科成员，大约120-180nm长。IHNV可侵害多种海水和淡水养殖鱼类，在欧、美、日、韩及部分亚洲国家流行，可通过鱼体及所产卵、精液、尿、粪便以及污染的饲料、水等传播，对养殖场造成致命打击，危害非常严重。

目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐、检测周期长、且灵敏度低。免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，具有特异性强、敏感性高的优点，但步骤相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应（PCR），快速、灵敏，但是需要进行琼脂糖凝胶电泳并通过溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。

发明内容

本发明的目的是提供辅助鉴定传染性造血器官坏死症病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及基于液相芯片检测传染性造血器官坏死病毒的方法。

本发明提供的辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。

本发明还提供了辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针T1组成；所述探针T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于制备辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的试剂盒。

所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的试剂盒，包括所述特异引物对或所述引物探针组合物。

本发明还保护一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增；如果所述RT-PCR扩增得到了扩增产物，待测病毒为候选的传染性造血器官坏死病毒；如果所述RT-PCR扩增没有得到扩增产物，待测病毒为候选的非传染性造血器官坏死病毒。所述扩增产物的大小可为100-250bp之间，具体可为126bp。所述待测病毒可为传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒或病毒性神经坏死病病毒。

本发明还保护另一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增后与所述探针T1进行杂交，如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的传染性造血器官坏死病毒，如果杂交结果为阴性待测病毒为候选的非传染性造血器官坏死病毒。所述待测病毒可为传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒或病毒性神经坏死病病毒。

所述辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法具体包括如下步骤（液相芯片法）：

（1）以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增；

（2）制备微球悬液

①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡20s，取75μL（约含3×10⁶个微球）置于1.5mL离心管中，10000g离心1min，弃上清；

②在步骤①的离心管中加入50μL0.1mol/L N-甲基咪唑水溶液（pH4.5），漩涡混合，超声波处理30-60秒（400W的功率,每超声9秒停6秒）；

③在步骤②的离心管中加入1.0nmol所述探针T1，漩涡混合；

④在步骤③的离心管中加入2.5μL碳二亚胺溶液（碳二亚胺溶液的制备方法：将10mg碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配）充分混匀，室温避光孵育30min；

⑤在步骤④的离心管中加入2.5μL碳二亚胺溶液（碳二亚胺溶液的制备方法同上）充分混匀，室温避光孵育30min；