[发明专利]基于液相芯片检测对虾白斑病病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及辅助鉴定对虾白斑病病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，更具体涉及基于液相芯片检测对虾白斑病病毒的方法。

背景技术

对虾白斑病(White spot disease，WSD)是世界范围内对海水对虾养殖危害最为严重的对虾病毒病之一，由白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)引起。白斑综合症病毒又称对虾白斑病病毒。1993年日本首次报道养殖的日本对虾暴发WSD。随后的研究发现，WSD不但可以使各个生长阶段的斑节对虾和日本对虾致病和死亡，而且还会引起包括蟹和鳌虾在内的许多淡水和海水甲壳类生病，发病3-10天内死亡率达到100%，造成严重的经济损失。1996年起在中国大面积暴发WSD，使中国对虾养殖遭受严重打击，对虾减产70%，至今未能恢复。

近年来，在许多野生甲壳类动物中先后检出WSSV，表明WSSV己经在野生环境中蔓延开来。为此，各国把建立灵敏的检测方法放在研究的首位，利用这些检测方法筛选带病虾和无病虾，来对WSD进行预防和控制，繁殖疾病的蔓延，保障养殖对虾的种质和对虾养殖业的健康发展。

由于目前还没有对对虾敏感的连续细胞系，因此分子生物学检测方法成为检测和诊断对虾病毒的主要手段。其中，以原位杂交和PCR应用得最为广泛。原位杂交具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。PCR方法比较快速、灵敏，但是需要溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是强致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。

发明内容

本发明的目的是提供辅助鉴定对虾白斑病病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，更具体涉及基于液相芯片检测对虾白斑病病毒的方法。

本发明提供了辅助鉴定对虾白斑病病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。

本发明还提供了辅助鉴定对虾白斑病病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针T1组成；所述探针T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于制备辅助鉴定对虾白斑病病毒的试剂盒。

所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于辅助鉴定对虾白斑病病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定对虾白斑病病毒的试剂盒，包括所述特异引物对或所述引物探针组合物。

本发明还保护一种辅助鉴定对虾白斑病病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；如果所述PCR扩增得到了扩增产物，待测病毒为候选的对虾白斑病病毒；如果所述PCR扩增没有得到扩增产物，待测病毒为候选的非对虾白斑病病毒。所述扩增产物的大小可为100-250bp之间，具体可为232bp。所述待测病毒为对虾白斑病病毒或流行性造血器官坏死病毒。

本发明还保护行另一种辅助鉴定对虾白斑病病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增后与所述探针T1进行杂交，如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的对虾白斑病病毒，如果杂交结果为阴性待测病毒为候选的非对虾白斑病病毒。所述待测病毒为对虾白斑病病毒或流行性造血器官坏死病毒。

所述辅助鉴定对虾白斑病病毒的方法具体包括如下步骤（液相芯片法）：

（1）以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；

（2）制备微球悬液

①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡20s，取75μL（约含3×10⁶个微球）置于1.5mL离心管中，10000g离心1min，弃上清；

②在步骤①的离心管中加入50μL0.1mol/L N-甲基咪唑水溶液（pH4.5），漩涡混合，超声波处理30-60秒（400W的功率,每超声9秒停6秒）；

③在步骤②的离心管中加入1.0nmol所述探针T1，漩涡混合；

④在步骤③的离心管中加入2.5μL碳二亚胺溶液（碳二亚胺溶液的制备方法：将10mg碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配）充分混匀，室温避光孵育30min；

⑤在步骤④的离心管中加入2.5μL碳二亚胺溶液（碳二亚胺溶液的制备方法同上）充分混匀，室温避光孵育30min；

⑥在步骤⑤的离心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混匀，10000g离心1min，弃上清；