[发明专利]酿酒酵母株系的一株重组工程菌OsAMT1;1-pYES2/31019b及其制备方法

权利要求书

1.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）株系的一株重组工程菌OsAMT1;1-pYES2/31019b，其保藏号为CGMCC No.7254。

2.如权利要求1所述重组工程菌的制备方法，其特征在于：

a)以水稻铵转运体基因OsAMT1;1和酵母表达载体pYES2构建重组质粒OsAMT1;1-pYES2；

b)用电击转化法将重组质粒OsAMT1;1-pYES2转入铵转运体缺失突变体酵母菌株31019b中，将电击后的混合液涂布在含有2mM精氨酸,2%半乳糖和0.17%YNB的筛选平板上，30℃培养3天，待酵母长出后，经PCR鉴定，获得重组酵母工程菌OsAMT1;1-pYES2/31019b。

3.根据权利要求2所述重组工程菌的制备方法，其特征在于：以水稻铵转运体基因OsAMT1;1和酵母表达载体pYES2构建重组质粒OsAMT1;1-pYES2是指：

a)针对GeneBank中注册号为AF289477，核酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2的水稻铵转运体基因OsAMT1;1设计的上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4，其中，SEQ ID NO.3中含有KpnI酶切位点GGTACC，SEQ ID NO.4中含有NotI酶切位点GCGGCCGC ；

b) 以水稻的cDNA 为模板，利用PCR技术扩增5’端带KpnI 酶切位点，3’端带NotI 酶切位点的OsAMT1;1基因序列，其PCR的反应体系为：酶活单位为2.5 U/μl的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，0.1μl,终浓度为均为0.2μmol/L上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各1μl, cDNA 2μl, 双蒸水29.4μl,DMSO2.5μl, 2.5mM的dNTPs 4μl, 5×PrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus)10μl.反应过程为：95℃预变性5min，随后以95℃ 1min，60℃ 1min, 72℃ 2min，进行30个循环反应，再72℃延伸10min；随后结束反应；

c)将b步骤的PCR产物用醋酸钠乙醇沉淀，沉淀物干燥后用无菌超纯水溶液溶解，溶解物用KpnI和NotI 双酶切，胶回收酶切产物；用同样的方法对pYES2质粒进行酶切和胶回收；

d) 分别取7.5μl的PCR酶切回收产物和1μl的pYES2质粒酶切回收产物，1μl的10×T₄ DNA连接酶Buffer 和0.5μl的T₄DNA连接酶，在16℃连接仪上连接12小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞，然后在含有100mg/L 氨卞青霉素的LB平板上37℃培养过夜，待单克隆长出；

 e) 将d 步骤中长出的单菌落在含有100mg/L氨卞青霉素的LB培养液中37℃，220rpm摇床培养过夜，收集菌体，提取质粒，经KpnI和NotI 双酶切并测序鉴定，获得重组的OsAMT1;1- pYES2质粒。