[发明专利]一种具有纤维素和木聚糖催化活性的双功能酶

说明书

技术领域：

本发明涉及一种具有纤维素和木聚糖催化活性的双功能酶，属于生物技术领域。 

背景技术：

纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，同时也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们相互协同作用，将纤维素分解为寡糖和纤维二塘，最终水解为葡萄糖。而半纤维素是陆生植物中除纤维素外含量最丰富的碳水化合物。它由阿拉伯糖、半乳糖、木糖、及甘露糖几种单糖聚合而成，其中木聚糖是半纤维素中最具代表性的组分之一，其骨架为β-1,4-糖苷键相连的吡喃木糖主链，根据来源的不同，侧链的取代基也不同。目前主要有两类木聚糖酶，分别为β-1,4-木聚糖酶和β-木聚糖酶，这两种酶共同作用能将木聚糖降解为单糖。双功能酶是指酶蛋白的一条多肽链同时具有两种水解酶活性，进而能催化完成两个不同的生物反应过程，在其催化过程中往往会涉及到数目很多的中间体酶蛋白结构。在自然界中，纤维素通常与木聚糖等半纤维素结合存在，因此天然的菌株中有很多菌都能产生纤维素和木聚糖双功能酶，但是主要来源的菌种有Clostridium papyrosolvens, Paenibacillus curdlanolyticus, Clostridium thermpcellum, Clostridium cellulovorans, Caldicellulosiruptor saccharolyticus.  

不同种（属）的微生物所产生的双功能酶发挥作用的结构域也不同，比如由Murashima等人报道的纤维素酶-木聚糖酶复合体，只有在两个结构域都存在时才能将植物细胞壁降解，而两个单独的结构域则没法分解。而一株来源新西兰温泉的能解糖解纤维素菌（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）的双功能酶的结构域是一个多结构域水解酶，它包括一个GH 10家族、一个GH 5家族催化结构域以及三个与底物结合的区域。 

尽管有很多种微生物能产生纤维素和木聚糖双功能酶，但是要从天然的菌株中分离并纯化出这些酶是比较费时、费力、成本非常的昂贵，而且天然菌株所产的酶产量并不高，需要进一步通过物理、化学的诱变或者分子生物学手段来提高 菌株的产酶量。但是如果能利用基因工程手段，将纤维素酶结构域中起催化作用的催化结构域与木聚糖酶结构域中与木聚糖催化作用相关的结构域相结合，这样就能够达到一种酶能同时具有纤维素酶和木聚糖双酶活的酶，最重要的是重组后的双功能酶的纯化步骤很简单，只需一步亲和层析就能够达到电泳纯。在前期的研究中，我们发现，ThCel9A的C端有两个似乎与功能无关的FnⅢ和一个CBM2，随后我们又发现一个木聚糖酶ThXyn11A的C端也有一个CBM2。本发明利用ThXyn11A（除去信号肽）来替换ThCel9A的C端FnⅢ及其后面的CBM2。 

由于耐热或耐高温木聚糖酶、纤维素酶在造纸、饲料、食品、农业废弃物循环利用等工业具有广泛的应用，因而近年来关于这方面的专利报道也较多。但是关于纤维素和木聚糖双功能酶的专利报道却很少。网上公布的信息中仅仅只有专利号为201210084663公开了一种纤维素和木聚糖酶双功能酶具有一定的耐热性，能作为一种料添加剂应用于饲料等行业中。 

生物脱墨因其污染小、效率高，近年来在世界范围内被广泛的关注。目前国内外应用于生物脱墨中大部分使用的都是纤维素酶和木聚糖酶，其他酶在这方面的研究较少。在造纸工业中，同时具有纤维素酶活性和木聚糖酶活性的双功能酶在废纸脱墨时能提高纸浆纤维裂段长、耐破指数以及撕裂指数。在改善纤维素的裂段长、打浆性能以及改善滤水性等方面效果较好，而且木聚糖酶又有利于降低纸浆的脆性，因此双功能酶中两种酶活性同时存在的时候效果最佳。但在纸浆的漂白过程中，双功能酶的木聚糖酶活性在降解木聚糖是木质素暴露于漂叶使纸浆得以漂白的同时也会是纤维素降解，从而使得纸浆的强度降低。而本研究中得到的纤维素和木聚糖双功能酶中的纤维素酶活性在高温条件下酶活损失较大，因此在漂白的过程中纤维素酶活就会变得很弱，因而这种随着条件改变而相对应的改变酶活性的性质对于其他的工业也有很多使用的价值。在饲料、食品以及果蔬加工中，双功能酶可部分的替代粥化酶（纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶及淀粉酶的混合酶），在条件相对而言较为温和的条件下破坏原料的组织和细胞结构。而且相对于多种单一功能酶的混合物而言，双功能酶在降低生产成本、提高企业的效益方面都有着无法比拟的优势。因而，开发并利用双功能酶就显得十分必要了。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有纤维素和木聚糖催化活性的双功能酶。 

本发明的目的通过如下技术方案实现：