[发明专利]一种高转化效率的大肠杆菌表达菌株

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种高转化效率的大肠杆菌表达菌株。 

背景技术

酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。高催化活性以及高催化专一性的酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率的蛋白突变体库的基础之一。突变体库也是研究基因或蛋白的结构和功能的关键手段。 

常规的得到蛋白突变体的实验步骤是将通过特定方法（如DNA shuffling和易错PCR)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌如DH10B或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源异源蛋白表达宿主菌。其中大肠杆菌BL21(DE3)是最为常用的宿主菌，其他的菌株一般为此菌株的衍生菌株。采用提取质粒再转化BL21(DE3)的两步法而非直接转化BL21(DE3)的原因在于后者的转化效率较低，一般低十倍以上。低效率使得获得目的突变的几率大大降低而不被采用。两步转化法不仅增加了实验步骤，更为关键的是造成了一定量的（也可能是非常关键的）突变体库的损失。 

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株，该菌株是将大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)基因组中的hsdR基因敲除而获得。 

本发明所述的大肠杆菌表达菌株，是埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC No.7123或其变异体。 

埃希氏大肠杆菌CGMCC No.7123是通过以下方法获得：首先将hsdR基因上下游各500bp的同源片段以及两侧含有18bp I-SceI酶切位点的氯霉素抗性基因通过重叠延伸PCR融合在一起，此线性融合片段还包含下游500bp的同源片段之后的50bp的序列。将此线性融合片段电转化至表达重组酶的BL21(DE3)，由重组酶催化同源片段之间的同源重组而将线性融合片段取代BL21(DE3)基因组上的hsdR基因部分，hsdR基因被敲除。随后经诱导表达的I-SceI作用于所得菌株基因组中的I-SceI酶切位点，引起基因组双链的断裂。此时菌株利用自身的同源重组系统如recA和recBCD催化线性整合片段和500bp的同源片段下游的两个50bp片段之间发生同源重组，即将两个片段之间的序列以及其中的一个片段去除，经过此步骤，修复了基因组双链的断裂，菌株恢复生长。最终得到hsdR基因敲除、且不含有任何的外源碱基序 列的基因工程菌株。 

重组工程的基本原理是利用重组酶催化同源片段之间发生重组，而将基因组上的基因进行敲除。由于可以直接采用PCR扩增的中间含有抗性基因的线性同源片段（而无需将片段克隆至载体）进行转化，因此重组工程方法高效简便和快捷。本专利申请所使用的重组酶基因是指来源于λ噬菌体的redα，redβ和redγ基因，重组酶基因是由IPTG诱导的受LacI基因所调节pLac启动子所驱动；I-SceI基因是由L-阿拉伯糖诱导的受araC基因所调节的pBAD启动子所驱动。LacI基因和araC基因的调节系统均为严谨调节系统，即不加诱导剂时，启动子下游的基因几乎不表达，这就保证了重组酶表达的严格时空性，不会过量表达而引起异常重组。BL21(DE3)基因组上不含有I-SceI酶切位点，故以I-SceI酶切可表现出良好的专一性。 

hsdR基因编码I型限制性内切酶，其功能可能是降解外源DNA。本专利将之敲除发现hsdR基因敲除变株较原株BL21(DE3)转化效率提高14.5倍，达到4.5x10⁷/μg，原理上任何突变体可通过此高转化效率的菌株获得。从变株中提取的质粒酶切和蛋白表达实验确证了菌株的高转化效率，也证明了质粒在其中的正确复制和表达。高转化效率突变株将减少一个实验步骤，有利于简便快捷地获得突变体蛋白库。所获的菌株