[发明专利]一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达载体，尤其涉及一种融合型原核表达载体及其构建方法，本发明进一步涉及该融合型原核表达载体在表达外源蛋白中的应用，属于融合型原核表达载体领域。

背景技术

自1983年人免疫缺陷病毒（HIV-1）首次从一个全身淋巴结肿大的病人体内分离出来以来，在对病毒生活周期以及HIV-1编码的九个基因的功能意义的理解上已经取得了巨大的进步。大量的注意力被放在了HIV-1的四个开放读码框Vif，Vpr，Vpu和Nef上。这些基因最初被称为附属基因，这些基因产物共同调节宿主细胞生理来利于病毒复制，它们在HIV-1的致病机制中起很大的作用，特别是Vpr蛋白的表达，它导致细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡。

人免疫缺陷病毒（HIV-1）的病毒蛋白R（Vpr）含有96个氨基酸残基，分子量大约为14KD，在HIV-1，HIV-2，SIV中高度保守。Vpr对AIDS的致病机理极其重要，研究表明Vpr在病毒复制过程中具有多种功能：1.影响反转录过程的准确性；2.作为前整合体复合物的一个组成部分参与病毒DNA转运至细胞核；3.使被感染细胞的繁殖周期发生G2期阻滞；4.诱导病毒被感染细胞的凋亡；5.与宿主基因共同反式激活HIV-1长末端重复序列（Long terminal reprat,LRT）。因此，研究HIV病毒的Vpr蛋白对于艾滋病的致病以及发病和后期的治疗具有一定的意义。

β2微球蛋白（β₂M）基因编码的是一个只有99个氨基酸组成的小分子蛋白质，现有大量的文献资料显示，该基因可以在大肠杆菌中高效表达，可达到总蛋白30%。迄今为止，没有文献报道将难以表达的目的蛋白基因融合在β2微球蛋白基因的下游后进行表达能够提高目的蛋白在原核系统中的表达效率。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种融合型原核表达载体，该表达载体能够将不易表达的蛋白在原核系统中进行高效表达；

本发明的目的之一是提供一种构建所述融合型原核表达载体的方法；

本发明的目的之三是将所述融合型原核表达载体应用于在原核系统中表达外源蛋白。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种融合型原核表达载体，包括：启动子、纯化标签基因、蛋白酶切割位点、多克隆位点和终止子；其中，在纯化标签基因和蛋白酶切割位点之间连接有β2微球蛋白基因；纯化标签基因位于启动子的下游，多克隆位点位于蛋白酶切割位点和终止子之间。

所述β2微球蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

所述的启动子可以大肠杆菌表达体系中常用的启动子，例如可以是lac启动子、trp启动子、P₁启动子、由lac启动子-10区和trp启动子-35区融合形成的tac启动子或Tn5启动子等。

所述的纯化标签可以为his标签、avidin标签、t7标签或myc标签等，优选为his标签。

所述的蛋白酶切割位点的蛋白酶可以为PSP酶、肠激酶或凝血酶等，优选为PSP酶。

本发明的另一目的是提供一种构建所述融合型原核表达载体的方法，包括：（1）将纯化标签基因、β2微球蛋白基因、蛋白酶切割位点和多克隆位点依次连接在一起，得到融合基因：（2）将融合基因可操作的与原核表达载体的启动子和终止子连接在一起，即得；其中，融合基因序列位于原核表达载体的启动子下游。

其中，所述的原核表达载体可以是pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK、pBAD或pBV220等原核表达载体；优选为pET28a。

所述的融合基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了利用所述融合型原核表达载体生产外源蛋白的方法，该方法包括：将外源蛋白基因可操作的插入到上述融合型原核表达载体中得到含有外源蛋白基因的重组融合型原核表达载体，再将该重组融合型原核表达载体表达载体导入宿主细胞，获得重组菌株；培养重组菌株，诱导外源基因表达，收集表达产物，分离纯化，即得。

所述外源蛋白优选为不易表达的蛋白，尤其是多肽、小蛋白或毒性蛋白等，优选为HIV的Vpr蛋白；所述HIV的Vpr蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

所述的宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、蓝藻、或衣藻等，优选为大肠杆菌BL21。