[发明专利]一种猪性别控制精子及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种家畜性别控制精子分离技术，特别是涉及一种猪性别控制精子及其制备方法和应用。

背景技术

动物的性别控制(sex control)技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术，其在畜牧生产中具有重要意义。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳、产蛋)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)，从而获得最大的经济效益；其次，通过控制后代的性别比例可增加选种强度、加快畜禽育种进程，同时也可提高珍稀动物的繁殖、保种进程，从而挽救濒临灭绝的珍稀动物；通过控制胚胎性别可以及时克服牛胚胎移植中出现的异性双生不育的现象，从而排除伴性有害基因的危害；此外，还可以用于防止性连锁遗传疾病，迅速降低伴性有害基因在群体中的频率。

性别控制的途径有两种，一是在受精之前是通过对精子的体外干预，使在受精之时便决定了后代的性别；二是在受精之后则是通过对胚胎性别进行鉴定，从而获得所需性别的后代。前者是动物性别控制最为有效的途径。在哺乳动物中，每一个体的X精子和Y精子的DNA含量是恒定的，相差多在3.6-4.2%之间，流式细胞分离仪就是利用这种差异，借助特异性染色剂染色，然后根据发出的荧光强度，再通过计算机来预测精子类别。目前这种技术已被广泛应用于奶牛、羊、鹿等性别控制精子的分离。

如授权公告号为CN101347458B的中国发明专利公开了一种羊X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用，其应用羊X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制冷冻精液，其冷冻保存条件为-90～-120℃处理20-30分钟。此发明得到的冷冻精液在用于以人工授精方式或胚胎移植方式控制羊产羔的性别时分离效率高，性别控制准确率可达90%以上，适用于产业化生产和养殖，从而大幅度提高养殖效应。

又如公开号为CN101411722A的中国发明专利公开了一种奶牛性别控制冷冻混合精液的生产新技术，其以山羊精液作为基础，加入不同比例的分离X/Y精液来生产奶牛X/Y性别控制冷冻精液。此技术可以使奶牛X/Y性别控制冷冻精液的生产效率提高2-4倍，并且提高了冻精解冻后精子的活力、顶体完整率，延长了冻精解冻后具有授精能力的时间，使母牛的平均情期受胎率达到50%以上，性别控制准确率达到90%以上。

猪的X和Y精子之间DNA含量的差异较小，仅为3.6%，因此不容易被分辨；并且，猪精子在进行分离处理过程中极易受损，例如在分离过程中的稀释、染色、挤压、激光照射等处理都会猪精子造成一定的影响，从而降低精子的品质、受精能力及存活时间；此外，猪精子人工授精需要的数量大、分离所需的时间长、冷冻猪精子在解冻后活力不高（实验室一般情况也仅有40%左右）等因素都导致这种性别控制技术在猪的应用上存在一定的难度。

公开号为CN101613677A的中国发明专利公开了一种分离猪X精子和Y精子的方法，将采集的公猪精液在30℃±2℃的温度下暂时保存后，用精液稀释液按适当比例稀释原精液，然后加入适当浓度的荧光染色剂进行染色，再加入食物色素染色后过滤，随后在20℃～25℃下利用流式细胞仪分离X、Y精子，并用装有精子接收液的接收管收集分离后的X、Y精子，经离心浓缩后可用于保存或授精。利用此方法分离猪精子可提高X、Y精子的分辨率和分离准确率，然而其精子活力仍有待提高，此外该专利并未对分离的精子的冷冻保存以及解冻后精子活力作进一步研究。

由于猪精子对外界温度的突变改变相当敏感，特别是在迅速冷却至0-15℃时极易失去活力，此外解冻后的精子易产生活力丧失、精子膜的选择通透性降低、顶体膜损伤等现象，目前在生产上难以像牛的精液冷冻一样得到普遍地推广应用。授权公告号为CN101869101B的中国发明专利公开了一种猪精液冷冻保存方法，该方法要求精液样品新鲜精液活力≥0.7，冷冻时先配制猪精液冷冻稀释液配方与稀释液，在稀释精液后预冷平衡，再将精液滴冻，最后解冻精液和进行冻后活力检查。此发明虽能较好地保证冻后精子的活力、存活率、质膜完整率、顶体完整率及线粒体活性，然而此冻存方法相对繁琐。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种简单、实用、易于操作的猪性别控制精子及其制备方法和应用，本发明方法能够有效避免猪X、Y精子在分离过程中受到损伤，从而提高精子的品质和受精能力，并延长精子的存活时间，此外分离的精子在进行授精时所需剂量低。

为了达到上述目的，本发明一方面提供一种猪性别控制精子的制备方法，包括如下步骤：