[发明专利]适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法及其应用

权利要求书

1.一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)PCR扩增ST3GAL I片段：

以如下引物：

ST3GAL-F：5′-ATTTGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCACCGTCAGGAAAAGGAAC-3′；ST3GAL-R：5′-CGTCTAGAGGTCATCTGCCCTTGAAAAAT-3′。

以pESG-T-ST3GAL I质粒为模板，PCR扩增ST3GAL I基因序列，收集1000-1050bp的扩增引物；

(2)重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I的构建

将扩增序列连接到pMD18-T载体上得重组质粒pMD-ST3Gal I，使用Not I、Xba I分别双酶切pMD-ST3Ga I和pcDNA3.1-EGFP，酶切产物在T4DNA ligase的作用下连接，得重组表达质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I；

(3)BHK细胞的转染

BHK细胞在转染前一天接种，培养18～24h至70-90％细胞汇合，使用转染试剂将重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3Gal I转染BHK细胞；

(4)抗性细胞克隆的筛选

待转染20-28h后，换用含有G418(700-900ug/mL)的DMEM培养液进行筛选，2周后G418改为300-500ug/mL维持剂量筛选，挑选抗性细胞集落，按有限稀释法进行单细胞克隆，得到适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系。

2.鸡新城疫病毒的增殖方法，包括如权利要求1所述的适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的步骤，其特征在于包括新城疫病毒Lasota株感染BHK细胞系的步骤。